Method Article

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

DOI:

10.3791/60022

⸱

March 1st, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מתודולוגיה זו היא לזהות את תאי גזע הסרטן (csc) בקווי התאים של סרטן ודגימות הגידול האנושי הראשוני עם הפרוטוקול ליצירת כדור, בצורה איתנה, באמצעות בחני פונקציונלי ואפיון פנוטימית עם זרימה cy, try ומערבי מחוק.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע סרטניים (CSC) הם אוכלוסיה קטנה עם התחדשות עצמית ופלסטיות אשר אחראים tumorigenesis, עמידות לטיפול ומחלות חוזרות ונשנות. אוכלוסיה זו יכולה להיות מזוהה על ידי סמנים פני השטח, פעילות אנזימטית ופרופיל פונקציונלי. גישות אלה לכשעצמו מוגבלות, בשל הפלסטיות הטרוגניות ו-CSC. כאן, אנו לעדכן את פרוטוקול יוצרי הספירה כדי להשיג כדורים CSC מסרטן השד גינקולוגית, הערכת תכונות פונקציונלי, סמנים CSC וביטוי חלבון. התחומים מתקבלים עם שימוש בתאי יחיד בצפיפות נמוכה בתרבות ההשעיה, באמצעות מדיום חצי מוצק מתילצלולוזה כדי למנוע הגירה ואגרגטים. פרוטוקול זה רווחי ניתן להשתמש בקווי תאים סרטניים, אלא גם בגידולים ראשוניים. התרבות הטריממדי הלא חסיד ההשעיה חשב לחקות את מיקרוסביבה הגידול, במיוחד CSC-נישה, הוא שיושלם עם גורם גדילה באפידרמיס וגורם גדילה בסיסי הפיצוץ כדי להבטיח איתות CSC. במטרה לזהות חזקה של CSC, אנו מציעים גישה משלימה, שילוב פונקציונלי הערכה פנוטימית. יכולת להרכיב כדור, אזור התחדשות עצמית והקרנת כדור ליצור תכונות פונקציונליות CSC. בנוסף, האפיון כולל את הערכת הזרימה של הסמנים, המיוצגים על ידי CD44+/Cd24-ו- CD133, ואבן החשופה המערבית, בהתחשב ב-aldh. הפרוטוקול המוצג היה גם אופטימיזציה עבור דגימות הגידול הראשוני, בעקבות הליך העיכול לדוגמה, שימושי עבור מחקר טרנסלtional.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוכלוסיות סרטן הן הטרוגנית, עם תאים המציגים מורפולוגיות שונות, התפשטות וקיבולת הפלישה, בשל ביטוי גנים דיפרנציאלי. בין תאים אלה, אוכלוסיית המיעוט קיים בשם תאים גזע הסרטן (CSC)1, אשר יש את היכולת של התחדשות עצמית, לכידה של טרוגניות של נישה הגידול העיקרי והפקת מושלתי בצורה מאוד מבדילים שאינם מגיבים כראוי להומטיק שולטת2. מאפייני CSC ניתן לתרגם ישירות בפרקטיקה הקלינית, בהתחשב הקשר עם אירועים, כגון התנגדות או עמידות כימותרפיה3. הזיהוי של CSC יכול להוביל לפיתוח של טיפולים ייעודיים העשויים לכלול חסימה של סמנים פני השטח, קידום של בידול CSC, חסימת של רכיבים מסלול איתות CSC, השמדת נישה, ו אפיגנטי מנגנונים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בוצע להיענות להנחיות המוסריות של בית החולים קוימברה והמרכז הלאומי (CHUC) בבנק הגידולים, ואושר על ידי ועדת האתיקה של CHUC לבריאות ועל ידי הוועדה הלאומית להגנת הנתונים הפורטוגזית.

1. פרוטוקול היווצרות כדור ואוכלוסיות מתוונות מתרבויות תאים מתמשך

הערה: בצע את כל ההליכים תחת תנאים סטריליים נוקשים.

  1. הכנת מבחנות או צלחות על ידי ציפוי של משטח גדילה עם פולי (2-הידרוקסיל-מתיונין-מתיאקריז)
    1. להכין פתרון 15 מ"ג/mL על ידי ערבוב פולי HEMA באתנול מוחלט ב 65 ° c. התרבות תא הפרווה מבחנות או צלחות עם 50 μL/cm2.
    2. המשך להתייבש ב37 ° c בתנור ייבוש. אם יש צורך, עוטפים את הצלחות ומאחסנים ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול ליצירת הספירה מאפשר מושבות כדוריות להיות מושגת בהשעיה מתוך העיכול כמה קווי רירית הרחם וסרטן השד (איור 2א) או לאחר בדיקות אנזימטיות עדין של רקמה מדגימות הגידול האנושי (איור 2E). בשני המקרים, מספר ימים לאחר הציפוי, מושבות מונבטיים כדורית בהשעיה מתקבלים. הן הכדוריות רירית הרחם וסרטן השד מעניקים למונאולייר תא עם מורפולוגיה דומה לקו התאים של המקור, 1 עד 2 ימים לאחר ציפוי (איור 2א

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט גישה להשגת כדורים מתאי סרטן ודגימות אנושיות ראשיות. כדורים מועשר בתתי-אוכלוסיה עם מאפיינים כמו תאי גזע36. העשרה זו ב CSC תלויה הכדאיות בסביבה מעגן ללא התאים בזמן הבדיל מסתמך על הדבקה37מצע. כמו ציפוי ראשוני של תאים סרטניים בסביבה הקפדה נמוכה הכופה ההשעיה אינה מבטיחה העשרה ב-CSC למשל, אנו מספקים אסטרטגיות כדי להעריך את התחדשות עצמית (כדור להרכיב קיבולת והתחדשות עצמית), בידול קיבולת (אוכלוסייה נגזרת הנגזר), ו פנוטיפ של CSC (עם הזרימה cy, ו/או כתם המערבי). תאים.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי האגודה הפורטוגזית של גניקולוגיה באמצעות פרס 2016 מחקר על ידי CIMAGO. CNC. IBILI נתמך באמצעות הקרן עבור מדע וטכנולוגיה, פורטוגל (UID//או/04539/2013), ובמימון שיתוף על ידי פדר-להתחרות (POCI-01-0145-פדר-007440). בית החולים של קוימברה ומרכז האוניברסיטה (CHUC) בבנק הגידול, אושרה על ידי ועדת האתיקה של CHUC לבריאות ועל ידי הוועדה הלאומית להגנת נתונים פורטוגזית, היה המקור של דגימות רירית הרחם של חולים ואחריו בשירות גניקולוגיה של המוסד. איור 1 הופק בעזרת Servier אמנות רפואית, זמין מ www.servier.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אתנול אבסולוטיMerck Millipore100983
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutas מגיב דיסוציאציה של תאים
נוגדן ALDHSanta Cruz BiotechnologySC166362
Annexin V FITCBD Biosciences556547
תמיסה אנטיביוטית אנטי-פטרייתיתSigmaA5955
בדיקת BCAThermo Scientific23225ערכת בדיקת חלבון BCA פירס
אלבומין בסרום בקרסיגמאA9418
CD133 נוגדןMiteny Biotec293C3-APCאלופיקוציאנין (APC)
CD24 נוגדןBD Biosciences658331אלופיקוציאנין-H7 (APC-H7)
CD44 נוגדןBiolegend103020פסיפיק כחול (PB)
מסננת תאיםBD Falcon35234040 ומיקרו; M
קולגנאז, סוג IVGibco17104-019
cOmplete MiniRoche118 361 700 0
DithiothreitolSigma43815
DMEM-F12SigmaD8900
DNAse IRoche11284932001
ECC-1ATCCCRL-2923קו תאי אדנוקרצינומה של רירית הרחם האנושית
גורם גדילה אפידרמיסSigmaE9644
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסיSigmaF0291
HaemocytometerVWRHERE1080339
HCC1806ATCCCRL-2335קו תאי קרצינומה של תאי קשקש של חלב אנושי
אינסולין, טרנספרין, תמיסת סלניוםGibco41400045
MCF7ATCCHTB-22קו תאי אדנוקרצינומה של חלביות אנושיות
מתיל צלולוזAlfaAesar45490
NaClJMGS37040005002212
פולי (2-הידרוקסיאתיל-מתאקרילטסיגמאP3932
פוטרסיןסיגמאP7505
RL95-2ATCCCRL-1671רירית רחם אנושית קו תאי קרצינומה
נתרן חומצה דאוקסיקוליתJMSEINECS 206-132-7
נתרן דודציל סולפטסיגמא436143
TrisJMGS20360000BP152112
Triton-X 100Merck108603
טריפן כחולסיגמאT8154
טריפסין-EDTAסיגמאT4049
ß-נוגדן אקטיןסיגמאA5316

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142(2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cancer Stem CellsSphere FormationPolyHEMA CoatingMethylcellulose MediumFlow CytometryWestern BlotCD44 CD24 MarkersCD133 MarkerALDH ExpressionTumor Sphere Assay

Related Articles