כאן, אנו מתארים שיטה לגרום דלקת קרום הגרון דרך מסלול הזיהום התאיים בעכברים למבוגרים. אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול של דלקת קרום הגרון מתוך הכנת האיסיס לזיהום התאיים; לאחר מכן להקליט את ההישרדות בעלי חיים ולהעריך את העומסים חיידקי ברקמות murine.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גרימת דלקת קרום הגרון הקבוצה C בעכברים באמצעות משלוח התאיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מנינגוקוקוס הוא מיקרואורגניזם בטווח הצר, המזוהה באופן גלובלי כגורם המוביל לדלקת קרום הגרון החיידקית. מנינגוקוקוס הוא הקולוניאליסט ארעי של האף האנושי האדם של כ 10% של נושא בריא. בנסיבות מסוימות, היא מקבלת יכולת פולשנית לחדור אל מכשול המוקוסל ופולשת למחזור הדם הגורם לספטיתרמיה. במקרה האחרון, אלח דם שתוללת יכול להיווצר גם ללא ההתפתחות הסוגר של דלקת קרום המוח. לעומת זאת, חיידקים יכולים להתרבות בצורה גרועה במחזור הדם, לחצות את מכשול המוח בדם, להגיע למערכת העצבים המרכזית, המובילה לדלקת קרום הדם הרועמת. מודלים murine של דלקת הקרום החיידקי מייצגים כלי שימושי כדי לחקור את האינטראקציות המארחים הפתוגן ולנתח את המנגנונים הפתוגנטיים האחראים למחלה קטלנית זו. למרות, מספר מערכות מודל ניסיוני הוערכו בעשורים האחרונים, אף אחד מהם לא הצליחו לשחזר את האירועים הפתולוגיים האופייניים של מחלת קרום הגרון. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו מתארים הליך מפורט עבור אינדוקציה של דלקת קרום הגרון במודל העכבר מבוסס על החיסון התאיים של חיידקים. הסימנים השונים של דלקת קרום המוח האנושי נרשמו במארח murine באמצעות הערכה של פרמטרים קליניים (למשל, טמפרטורה, משקל הגוף), הערכה של שיעור ההישרדות, ניתוח מיקרוביולוגית ובדיקה היסטולוגית של פגיעה מוחית. בעת שימוש ב-תאיים (i. ושכב.), מסירה מלאה לגמרי ישירות לתוך cisterna מגנה, המובילה לשכפול מאוד יעיל של קרום המוח ברקמת המח. גידול 1,000 מקפלים של ספירה קיימא של חיידקים הוא נצפתה כ 18 h. יתר על כן, מניגוקוצ'י נמצאים גם בטחול, ובכבד של עכברים נגועים, הרומז כי הכבד עשוי לייצג איבר יעד עבור שכפול קרום הגרון.
מבוא
מנינגקוקוס היא β שלילית-פרוטקוביום מוגבל לפונדקאי האנושי, ידוע בהיותו אחד הגורמים השכיחים ביותר של דלקת קרום הגוף ואלח דם באוכלוסייה האנושית ברחבי העולם. הוא מקולוניא את מערכת הנשימה העליונה (האף והגרון) של נשאים בריאים ואסימפטומטיים (2-30% מהאוכלוסייה), אבל החיידק מתחמק לפעמים שונים הגנות החיסון העצמי מתפשט ממחזור הדם למוח גרימת מקומי בלתי מבוקרת דלקת, הידועה בשם. דלקת קרום הגרון שילוב של גורמים מארחים וחיידקיים מופיע כדי לתרום את המעבר מן הקומנדציה להתנהגות פולשנית1.
(ש ע) מנינגטידיס , מתמחה באופן בלעדי בקולוניזציה אנושית וזיהום. יש לו טווח מארח צר, ולכן, יש מוגבל במחקרים vivo בפתוגנזה בשל העדר מו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה נערך כדי למזער את הסבל בעלי חיים ולהקטין את מספר העכברים בהתאם להנחיות מועצת הקהילות האירופיות של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). ב vivo ניסויים שדווחו במחקר זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים אתית והשתמש הוועדה (פרוט. מספר 2, 14 בדצמבר 2012) ו משרד הבריאות האיטלקי (פרוט. מספר 0000094-A-03/01/1/2013). כל ההליכים יש לבצע בתוך הקבינט Biosafety טיחות 2 (BSC2) בחדר BSL2, ואת הפסולת הנגועה פוטנציאל צריך להיות מושלך מכולות ייעודי.
1. זיהום של עכברים עם N. הזנים של הקבוצה C מאמץ
זהירות: נ. מנינגטידיס היא פוטנציאל פתוגן מזיק וכל אמצעי הזהירות הנחוצים יש לנקוט בעת טיפול במיקרואורגנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הישרדות של עכברים נגועים ב -N. מנינגטידיס מסוג פראי וזנים מוטנטים איזוגניים.
זנים neisseria בשימוש בתוצאות אלה הנציגים הם קבוצת המסרוט C התייחסות מאמץ 93/4286 (ET-37) ואת המוטציה האיזוגנית שלו 93/4286Ωcssa שהושגו על ידי insertional איון פעלה של הגן cssa , קידוד עבור ה-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, כי מפות ב סינתזה הקפסולה לוקוס25. כדי להעריך את הרמה התקפה אלימה של מאמץ פגום Cssaבמודל murine הנוכחי, את המינון הקטלני מסוגל לקבוע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני לגרום דלקת קרום הגרון בעכברים למבוגרים על ידי i. ושכב. חיסון. של חיידקים מקרום הגרון לידיעתך, אין מודל אחר של קרום הגרון שפותחה בעכברי מעבדה נגועים על ידי i. ושכב. דרך בעבר, בדרך זו נחקרו כדי לספק מודלים של דלקת קרום הגרון בשני עכברוש31 ו ארנב32. זה ידוע כי השיעור הגבוה ביותר של מחלת קרום הגרון נמצא בין ילדים צעירים, מתבגרים, ומבוגרים צעירים33,34,35<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחקרים היו נתמכים בחלק על ידי מ2012 [מספר מענק 2012wjsx8k]: "מארח-חיידק אינטראקציה מודלים זיהומים רירית: פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות הרומן" ועל ידי מורה 2017 [2017sfbfer]: "גישה משולבת להתמודד עם הגומלין בין הסתגלות, תנאים מלחיצים ועמידות מיקרוביאלית של פתוגנים מאתגרים ".
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,8 חצאית Cryovial עם חוט חיצוני | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן | Falcon | 352070 | 30 מ"מ x 115 מ"מ |
| מלקחיים אדסון | FST | 11006-12 | |
| מדחום אזעקה | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD מזרק מיקרו עדין | BD | 320837 | U-100 אינסולין |
| BD מזרק פלסטיפק 1 מ"ל 25 גרם 5/8 אינץ' | BD | 300014 | 05 מ"מ x 16 מ"מ |
| מזרק BD פלסטיפק 5 מ"ל | BD | 308062 | 07 מ"מ x 30 מ"מ |
| BIOHAZARD AURA B ארון זרימה למינרית אנכית | Bio Air S.C.r.l. | Aura B3 | |
| ביופוטומטר | אפנדורף | דגם #6131 | |
| בקבוק D | Tecniplast | D | בוגר עד: 400 מ"ל, נפח כולל 450 מ"ל, 72 מ"מ x 72 מ"מ x 122 מ"מ |
| C150 CO2 קלסר אינקובטור | 9040-0078 | ||
| גוף כלוב Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 מ"מ3, שטח רצפה 370 ס"מ2 |
| תרבית תאים צלחת פטרי עם מכסה | תרמו מדעי | 150288 נפח עבודה: 5 מ"ל | |
| צנטריפוגה | Eppendorf | מיקרוצנטריפוגה 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| די-אשלגן מימן פוספט טריהידרט | קרלו ארבה | 471767 | |
| די-נתרן מימן פוספט נטול מים ACS-לניתוח | קרלו ארבה | 480141 | g1000 |
| תעודה סטנדרטית דיאטה | Mucedola srl. | 4RF21 | גלולת מזון לבעלי חיים |
| Dumont HP פינצטה 5 נירוסטה | F.S.T. על ידי DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 מ"מ 2< / sup> טיפ |
| איזון אלקטרוני | Gibertini | EU-C1200 | מקסימום 1200 גרם, d = 0.01 גרם, T = -1200 גרם |
| Eppendorf צינור מיקרוצנטריפוגה מנעול בטוח | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 גרם |
| מספריים משובחים במיוחד של בון | FST | 14084-08 | נירוסטה |
| עליון (מיני מבודד), H-Temp עם מהדקי נעילה | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC בסיס אגר | OXOID | CM0367 | |
| Gillies מלקחיים 1 x2 שיניים | FST | 11028-15 | נירוסטה |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 ליטר |
| מלקחיים Graefe | FST. | 11052-10 | רוחב קצה משונן: 0.8 מ"מ |
| מכסה פנימי | Tecniplast | 1264C116 | |
| תמיסת דקסטרן ברזל | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| ארון בטיחות מיקרוביולוגי קטמין אינטרווט | |||
| כובע | בורג PP780751 | מותג PP, מלקחיים לטיפול | |
| בעכבר | FST | 11035-20 | גומי משונן; משטח אחיזה: 15 מ"מ x 20 מ"מ |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 מ"ל |
| כפפות לטקס טבעיות | Medica | M101 | |
| ניו ברונסוויק קלאסי C24 אינקובטור שייקר | PBI בינלאומי | C-24 קלאסי ספסל אינקובטור שייקר | |
| פטרי PS כלים | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 מ"מ2 |
| Pipetman קלאסי P20 | גילסון | F123600 | 2-20 ומו; L |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μ LL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μ L |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| אשלגן כלורי | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 גרם |
| אשלגן דימימן פוספט | J.T. Baker Chemicals BV | 0240 | 1 ק"ג |
| PS מלקחיים חד פעמיים | VWR | 232-0191 | |
| מחלק נשלף | Tecniplast | 1264C812 | |
| צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים | פלקון | 352063 | 5 מ"ל |
| נתרן כלורי | MOLEKULA | מחזיק SS 41272436 | |
| ומסנן פוליאסטר | Tecniplast | 1264C | |
| מלקחיים דפוס סטנדרטי | FST | 11000-12 | מספריים |
| טנוטומיה של סטיבנס | FST | 14066-11 | |
| מספריים כירורגיים מנירוסטה - ToughCut | FST | 14130-17 | |
| כפפות ניטריל חד פעמיות מגע N טוף | Ansell | 92-500 | |
| מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד (ULT) Haier | DW-86L288 | נפח = 288 L | |
| מספריים וגנר | FST | 14070-12 | נירוסטה |
| קסילזין | אינטרווט |
מקורות
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
