פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.
מבוא
האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות1,2 ,3,4. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה7,8....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. עיצוב ובנייה של מדריך RNA (gRNA)
הערה: כל gRNA מורכב של 2 60 בסיס זוג (bp) oligונוגראודים, כי הם מוגלים כדי ליצור 100 bp כפול תקוע (ds) oligונואוטייד (איור 1א-ג). ציר הזמן עבור העיצוב gRNA, הדור, ויעילות חיתוך בדיקות הוא כ 2 שבועות (איור 2).
- בחר את אזור ה-DNA של עניין להיות הגנום נערך ולזהות 3-4 23 הרצפים bp להתאים את הפורמט, 5 '-G (N19) ngg-3 '. רצפים אלה צריך להיות ממוקם בתוך 20 bp של אזור הריבית.
הערה: ניתן לבצע את המיקוד במובן או בחוט האנטי-חוש. - הערכת רצפי gRNA עבור יתירות גנומית והסתברות מחוץ ליעד באמצעות משאב כגון CRISPOR ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דור של gRNAs והקרנה עבור אינדלים
כל gRNA ישוכפל לתוך וקטור פלמיד וביטא באמצעות מקדם U6. האנזים AflII הגבלה משמש כדי לאתר את הפלסמיד (addgene #41824) והוא ממוקם לאחר מקדם U6. הלהקה 100 bp שנוצר לאחר הריפוי של 2 60 bp oligos משוכפל לתוך הביטוי gRNA ביטוי באמצעות הרכבה DNA. לאחר הפקת פלמידים של gRNA, הם מhESCs לתוך הiPSCs ולאחר מכן עם CRISPS-CAS9 GFP בינוני (addgene #44719). התאים GFP + ממוינים לאחר 2 ימים כדי להעשיר עבור תאים מזוהמים מצופה (ראה סעיף 5). לאחר 10-14 ימים,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקרינה התומכת הצמיחה והישרדות התא לאחר תאים culturing בצפיפות נמוכה לאחר מיון התא. מוות תאים ניתן למזער על ידי שמירה על תאים עם 10 ng/mL bFGF ו-Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. ייתכן שפרוטוקול זה מותאם למז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מימון של הלב הלאומי, הריאות, ובדם המכון (NHLBI), המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענקים U01HL099656 (מ. פ. D.L.F.) ו U01HL134696 (למעלה ו D.L.F.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים | קורנינג | 352235 | |
| צלחות תרבית רקמות פוליסטירן 6 בארות | קורנינג | 353046 | |
| אנדונוקלאז הגבלת AflII | ניו אינגלנד Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 בינוני | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) | |||
| ערכת מיצוי ג'ל | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson ערכת הרכבה | ניו אינגלנד Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB לוחות אגר המכילים 50 μ גרם/מ"ל מגיב גזע ליפופקטמין קנמיצין | |||
| תרמופישר | (STEM00001) | ||
| גורם גדילה מטריג'ל מופחת (GFR) | קורנינג | 354230 | |
| פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) | |||
| מיצוי ג'ל נוקלאוספין וערכת ניקוי PCR | Macherey-Nagel | 740609 | |
| אינקובטור טלטול אורביטלי | |||
| וקטור pCas9_GFP | Addgene | 44719 | |
| צינורות רצועת PCR | ארה"ב Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase ו-5 פעמים; מאגר Phusion | ניו אינגלנד Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM ערכת מיני-הכנה מהירה פלסמיד | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM תאי Escherichia coli מוכשרים חשמלית | Takara | 636763 | |
| SOC בינוני | ניו אינגלנד Biolabs | B9020S | |
| TrypLE אקספרס אנזים | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 מעכב דיהידרוכלוריד/ROCK (ROCKi) | Tocris | 1254 |
מקורות
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
