ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Fabian  L. Cardenas-Diaz; Jean  Ann Maguire; Paul Gadue; Deborah L. French

doi:10.3791/60085

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方法論記事

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

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DOI:

10.3791/60085

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2019年9月25日

Fabian L. Cardenas-Diaz^*¹ , Jean Ann Maguire^*¹ , Paul Gadue¹^,²^,³ , Deborah L. French¹^,²^,³

¹Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, The Children's Hospital of Philadelphia, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。

要約

ヒト多能性幹細胞は、遺伝子機能を研究し、疾患に関連する特定の変異をモデル化するための強力なシステムを提供します。正確なヘテロジゴウス遺伝子改変の生成は、CRISPR-CAS9が第2対立遺伝子のインデル形成を媒介しているため困難である。ここでは、1 つだけが目的のシーケンス変更を表現する 2 つの修復テンプレートを使用して、この問題を克服するためのプロトコルを示しますが、両方のテンプレートには、再切断とインデル形成を防ぐためのサイレント変異が含まれています。この方法論は、DNAの遺伝子編集コード領域がヒト疾患および生物学を研究するための等元制御および変異ヒト幹細胞株を生成するのに最も有利である。さらに、遺伝子編集実験の労力とコストを削減するために、トランスフェクションおよびスクリーニング方法論の最適化が行われている。全体として、このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞モデルを利用した多くのゲノム編集プロジェクトに広く適用可能である。

概要

ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツール^である1,2 ^、3、4.これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な^疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動^性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。