Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dieet lipiden worden ingenomen als vrije vetzuren (FAs) door het intestinale epitheel. Deze FAS zijn intracellulair omgezet in triglyceriden (TG) moleculen, voordat ze worden verpakt in chylomicronen voor transport naar de lymfe of in cytosolische lipide druppels (LDS) voor intracellulaire opslag. Een cruciale stap voor de vorming van LDs is de katalytische werking van diacylglycerolacyltransferases (DGAT) in de laatste stap van TG-synthese. LDs zijn belangrijk voor de buffer van toxische lipiden soorten en reguleren van cellulaire metabolisme in verschillende celtypen. Omdat het menselijke darm epitheel regelmatig wordt geconfronteerd met hoge concentraties van lipiden, is LD-vorming van groot belang om homeostase te reguleren. Hier beschrijven we een eenvoudige assay voor de karakterisering en kwantificering van LD-vorming (LDF) bij stimulatie met het meest voorkomende onverzadigde vetzuren, oliezuur, in humane intestinale organoïden. De LDF-test is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD540, die het mogelijk maakt om LDs te kwantificeren met confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie. De LDF-test kan worden gebruikt om LD-vorming in menselijke intestinale epitheelcellen te karakteriseren, of om menselijke (genetische) aandoeningen te bestuderen die het LD-metabolisme beïnvloeden, zoals DGAT1-deficiëntie. Bovendien kan deze test ook worden gebruikt in een pijpleiding met hoge doorvoer om nieuwe therapeutische verbindingen te testen, die defecten in LD-vorming in intestinale of andere soorten organoïden herstellen.
Inleiding
Lipiden zijn een cruciaal onderdeel van het menselijk dieet en spelen een belangrijke rol in de systemische energieopslag en metabolisme. Wanneer geconsumeerd, dieet lipiden worden afgebroken in vrije vetzuren (FFAS) en monoglyceriden (MGS) door alvleesklier lipases. Deze substraten worden vervolgens ingenomen door de enterocyten van het intestinale epitheel, waar ze voor het eerst opnieuw veresterd worden naar diglyceriden (DG) door monoglyceriden acyltransferases (MGAT)-enzymen en vervolgens naar triglyceriden (TG) door diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Tot slot, deze TGS zijn geïntegreerd in ofwel chylomicronen voor export naar het ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten met menselijke weefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door het ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU). Geïnformeerde toestemming voor weefsel inzameling,-opwekking,-opslag en-gebruik van de organoïden werd verkregen van patiënten in het Wilhelmina Children's Hospital (WKZ)-UMCU.
1. voorbereiding van cultuur media
Opmerking: Dit protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. De organoïden moeten worden behandeld volgens de standaard richtlijnen voor celcultuur.
- Basaal kweekmedium bereiden.
Opmerking:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor een juiste analyse van LD-vorming mogen de organoïden niet te dicht bij de stimulatie met OA en daaropvolgende vlekken worden geseeld. Dit is vooral van belang voor de confocale en plaat lezer uitlezen, omdat overlappende organoïden de fluorescentie kunnen verstoren. Er wordt een voorbeeld gegeven van de juiste organoïde-zaaien dichtheid (Figuur 1A) en een cultuur met overlappende organogeniden (Figuur 1
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier bieden we een protocol om LD-vorming in humane intestinale organoïden te bepalen bij incubatie met oliezuur. Deze methode is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD54018, die de karakterisering en kwantificering van het totale volume van lipide druppeltjes binnen een organoïde cultuur mogelijk maakt. De procedures voor het vaststellen en handhaven van humane intestinale organoïde culturen zijn gepubliceerd vóór13, en een visuele gids van dit protocol .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken B. Spee voor het royaal verstrekken van LD540. Dit werk werd gesteund door een Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek subsidie (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) naar S.M.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | vriendelijk verstrekt door Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteïne | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producerende cellen (HEK293-mNoggin-Fc cellen) | MTA met J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleïnezuur | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS zonder Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicilline-Streptomycine (5.000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producerende cellen (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cellen) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-behandelde 24 welplates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-behandelde zwarte helderbodem 96 welplates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsine (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producerende cellen (L-Wnt-3A cellen) | MTA met J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Referenties
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
