Эта цель этого протокола состоит в том, чтобы производить химерные акколоты с гаплоидными передними конечностями, полученными из Cas9-мутагенизированной донорской ткани с использованием методов прививки эмбриональной ткани.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поколение химерных актолотлов с мутантными гаплоидными конечностями через эмбриональную прививку
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растущий набор генетических методов и ресурсов позволяет исследователям исследовать молекулярное происхождение способности некоторых видов саламандры, таких как аксолотлы, регенерировать целые конечности во взрослом возрасте. Здесь мы намечаем методы, используемые для генерации химерных актолотлов с Cas9-мутагенизированными гаплоидными передними конечностями, которые могут быть использованы для изучения функции гена и верности регенерации конечностей. Мы объединяем несколько эмбриологических и генетических методов, включая гаплоидное поколение с помощью активации in vitro, мутагенеза CRISPR/Cas9 и прививание тканей в один протокол для создания уникальной системы гаплоидного генетического скрининга в модельном организме регенерации. Эта стратегия сокращает количество животных, пространство и время, необходимое для функционального анализа генов в регенерации конечностей. Это также позволяет исследует регенерационные функции генов, которые могут потребоваться для других важных процессов, таких как органогенез, морфогенез тканей и другие важные эмбриональные процессы. Описанный здесь метод является уникальной платформой для проведения гаплоидного генетического скрининга в системе позвоночных.
Введение
Исторически сложилось так, что прививка эмбриональной ткани амфибий была важным методом для изучения фундаментальных механизмов биологии развития и регенерации. Аксолотль, вид саламандры, обладает впечатляющей способностью к регенерации тканей и сложных структур, таких как конечности и органы после травмы или ампутации. Аналогичным образом впечатляюще, они могут получать, без отторжения, ткани трансплантатов от других лиц на эмбриональных, юношеских и взрослых стадиях1,2,3. Регионы эмбрионов, которые производят целые структуры, такие как конечности, хвосты, глаза и головы, и ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные процедуры, используемые в этом протоколе, были утверждены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных йельского университета (IACUC, 2017-10557) и соответствовали всем федеральным правилам и руководящим принципам, регулирующим использование позвоночных животных. Все эксперименты на животных были проведены на Ambystoma mexicanum (аксолотлы) в помещениях в йельском университете.
1. Поколение диплоидных эмбрионов
- Получите диплоидные эмбрионы GFP, чтобы служить в качестве трансплантата хостов через естественное спаривание с помощью одного или двух родителей gfp 2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Развитие гаплоидных эмбрионов можно отличить от диплоидных эмбрионов по их фенотипу «гаплоидного синдрома»29. На стадии трансплантата гаплоидные эмбрионы обладают уменьшенной кривизной вдоль передней задней оси и неполным корпусом желтоковой вилки(рисунок 3А). Флуоресцентный микроскоп может быть использован для обеспечения того, чтобы гаплоидные эмбрионы были свободны от патернатно производных экспрессии GFP
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Есть несколько важных шагов в нашем протоколе для генерации гаплоидно-диплоидных химер, что операционный техник должен рассмотреть для последовательных результатов прививки.
Наиболее вероятной причиной неудачи гаплоидного поколения является плохое состояние активации in vitro. Надлежащее количество подвижной спермы должны быть использованы для активации яйцеклеток. Чтобы продлить подвижность, образцы спермы всегда должны поддерживаться при 4 градусах Цельсия. Перед нанесением любого образца сп.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Кэтрин Робертс за ее заботу о колонии аксолот. Финансирование этой работы было предоставлено Коннектикут Инновации Регенеративной медицины научно-исследовательский фонд (15RMA-YALE-09 и 15-RMB-YALE-01) и Eunice Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и человеческого развития (Индивидуальный постдокторской Стипендия F32HD086942).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| #55 Пинцет Dumont | Fine Science Tools | 11295-1 | Используйте только материал Dumostar (можно автоклавировать) |
| Амфотерицин B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 мл |
| Антибиотик-антимикотик 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| ципрофлоксацин | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (полисукроза 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Гентамицин | Сигма Олдрич | G1914-250MG | |
| Инкубатор для нагрева/охлаждения | RevSci | RS-IF-233 | |
| Хорионический гонадотропин человека | Merk Chorulon | ||
| Megascript T7 Набор для транскрипции | Thermo Fisher | AM1334 | 40 реакций |
| Охлаждение мироскопа Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 флакона по 50 &; г белка |
| каждый Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Уровень обработки |
| <сильный>Рецепты | |||
| 1,0x Модифицированный раствор Рингера (MMR) Марка) | 0,1 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO<суб>4, 2 мМ CaCl<суб>2, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ ГЕПЕС (рН 7,8), ph 7,4 | ||
| 40% раствор | 20 мМ NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,8 мМ NaHCO3, 0,2 мМ CaCl2, 4 мМ MgSO4, pH до 7,4 |
Ссылки
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
