В этом случае мы представляем подробный протокол для скрининга небольших пептидов, которые связываются с FGFR2 с помощью фаговычного дисплея пептидной библиотеки. Мы также анализируем сродство выбранных пептидов к FGFR2 in vitro и его способность подавлять пролиферацию клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Скрининг и идентификация малых пептидов Ориентация Фактор роста Фибробласты Рецептор2 с помощью Phage Дисплей Пептид библиотека
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеческий рецептор фактора роста (FGFR) состоит из четырех членов, а именно, FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4, которые участвуют в различных биологических деятельности, включая распространение клеток, выживание, миграцию и дифференциацию. Несколько аберраций в сигнальном пути FGFR, из-за мутаций или событий усиления генов, были выявлены в различных типах рака. Таким образом, последние исследования были сосредоточены на разработке стратегий, связанных с терапевтической ориентации FGFR. Текущие ингибиторы FGFR на различных стадиях доклинического и клинического развития включают либо небольшие молекулы ингибиторы тирозина киназы или моноклональных антител, с только несколько пептидных ингибиторов в трубопроводе. Здесь мы предоставляем протокол с использованием технологии фагового дисплея для проверки небольших пептидов в качестве антагонистов FGFR2. Короче говоря, библиотека фаговычных пептидов была инкубирована в тарелку, покрытую FGFR2. Впоследствии несвязанный фаг был смыт TBST (TBS - 0,1% "v/v" Tween-20), а связанный фаг был смыт с буфером 0,2 М глицин-HCl (pH 2.2). Элеттогенный фаг был дополнительно усилен и использован в качестве ввода для следующего раунда биопанирования. После трех раундов биопанирования пептидные последовательности отдельных фаговых клонов были идентифицированы по секвенированию ДНК. Наконец, экранированные пептиды были синтезированы и проанализированы на сродство и биологическую активность.
Введение
Рецепторы фактора роста фибробластов (FGFRs) играют ключевую роль в пролиферации клеток, заживлении ран и ангиогенезе in vivo1. Аномальная активация FGFR сигнализации наблюдается в различных опухолей2,3,4,5включает в себя усилениегенов, генные мутации, хромосомные аберрации, и чрезмерной лиганд секреции6 . Многие ингибиторы, нацеленные на FGFR, показали многообещающее терапевтическое воздействие в клинических испытаниях и в основном классифицируются на три типа: (1) малые ингибиторы киназы моле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка реагента
- LB (лисогенный бульон) средний: Растворите 1 г триптона, 0,5 г дрожжевого экстракта и 0,5 г NaCl в 100 мл H2O. Autoclave и храните при 4 градусах Цельсия.
- Тетрациклин запас: Подготовка 20 мг/мл в 1:1 этанол: H2O. Хранить при -20 градусов по Цельсию, и вихрь перед использованием.
- IPTG/X-gal решение: Смешайте 0,5 г IPTG (изопропил -D-1-thiogalactopyranoside) и 0,4 г X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-D-галактозид) в 10 мл DMF (диметилформамид). Раствор можно хранить при -20 градусов в течение одного года в темноте.
- Пластины Тетрациклина (Тет): Dissove 1 г бакто-триптона, 0,5 г дрожжевого ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Получение высокого сродства небольшой пептид ориентации FGFR2.
Для проверки фагов, ориентированных на FGFR2, в этом исследовании была использована библиотека Ph.D.-7. Схематическое представление рабочего процесса показано на рисунке 1. При этом количество фагов (ПФУ) оставалось неизменным, в то время как концентрация покрытия белка FGFR2 постепенно уменьшалась. Результаты фагов оговорпоказал, что количество восстановленных фагов постепенно увеличи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Комбинаторная фагная библиотека является мощным и эффективным инструментом для высокой пропускной связи скрининга новых пептидов, которые могут связывать молекулы мишени и регулировать их функцию13. В настоящее время, фаговык пептид библиотеки имеют широкий спектр применений. Например, они могут быть использованы для выбора биологически активных пептидов, связанных с рецепторными белками23,небелковые цели24,25, боле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о конфликте финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Научно-технической программой Гуанчжоу (No 2016201604030039).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ m Фильтр | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 см2 Маленькая чашка | Thermo | 150460 | |
| 70% этанол | Гуанчжоуский завод химических реактивов | 64-17-5-96 | |
| gIII секвенирование праймер | Синтез от Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-луночная пластина | Гнездо | 701001-2 | |
| Агар | Beyotime | ST004D | |
| Бакто-триптон | Оксоид | L0037 | |
| BALB/c 3T3 клетки | ATCC | CRL- 6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 набор | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM Hyclone | sh30243.01 | ||
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| ЭДТА | Инвитроген | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Глицин | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 система | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou завод химических реактивов | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | ||
| Завод | химических реактивов NaOH Guangzhou | 1310-73-2 | |
| PEG– 8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 набор пептидных пептидов фагового дисплея | New England BioLabs | E8100S | Содержащий библиотеку фагов Ph.D.-7, E. coli штамм хозяина ER2738 и контрольные белки внеклеточного домена M13KE |
| рекомбинантного FGFR2 внеклеточного домена | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Чистота > 97% |
| Синтез малых пептидов | от GL Biochem Ltd. (Шанхай, Китай) | ||
| Тетрациклин | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Экстракт дрожжей | Oxoid | ЛП0021 |
Ссылки
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Rev....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
