Method Article

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

DOI:

10.3791/60234

⸱

November 9th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבר ממצב השקט למצב בידול בשל הפלסטיות המטבולית שלהם במהלך היווצרות הדם. כאן, אנו מציגים שיטה ממוטבת למדידת נשימה מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס של HSPCs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטפאות בתאי הגזע (HSPCs) יש הפלסטיות המטבולית ברורים, אשר מאפשר להם מעבר מהמצב השקט שלהם למצב בידול כדי לקיים את הדרישות של היווצרות הדם. עם זאת, היה קשה לנתח את מצב חילוף החומרים (הנשמה מיטוכונדריאלי) של HSPCs בשל המספרים המוגבלים שלהם וחוסר פרוטוקולים ממוטבים עבור HSPCs שברירית, שברירי. כאן, אנו מספקים קבוצה של ברור, צעד אחר צעד הוראות למדוד נשימה מטבולית (שיעור צריכת החמצן; OCR) ו גליקוליזיס (שיעור חמצה מסחטות; ECAR) של מח עצם מורין-השושלתמינוסSca1+c-Kit+ (lsk) hspcs. פרוטוקול זה מספק כמות גבוהה יותר של LSK HSPCs מ מח עצם murine, משפר את הכדאיות של HSPCs במהלך הדגירה, מאפשר ניתוח השטף החילוץ של שאינם חסיד HSPCs, ומספק פרוטוקולי הזרקה אופטימיזציה (ריכוז וזמן) עבור תרופות מיקוד זרחון חמצוני ומסלולים גליקוליטיות. שיטה זו מאפשרת חיזוי מעמד חילוף החומרים ובריאות HSPCs במהלך פיתוח דם ומחלות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיוון שתוחלת החיים של כדוריות הדם הבוגרות ביותר קצרה, הומאוסטזיס של דם נשענת על התחדשות עצמית והבחנה של אוכלוסייה ארוכת חיים אך נדירה של תאי גזע המטקיים (HSPCs)1. HSPCs הם השקט, אבל הם מהירים להתרבות ולעבור בידול על הגירוי כדי לקיים את הדרישות של מערכת הדם. כמו כל מדינה סלולרית HSPC דורש דרישה bioenergetic ייחודית, שינויים מטבולית הם מנהלי מפתח של החלטות הגורל HSPC. לכן, אובדן הפלסטיות המטבולית, על ידי שינוי שיווי המשקל בין שקט, התחדשות עצמית, והבידול של HSPCs, לעתים קרובות מוביל הפרעות myelo או lympho ההתרבות. יחד, ההבנה של רגולציה המטבולית של הפיתוח hspc הוא קריטי לחשוף מנגנונים בבסיס ממאירות המטקולוגי2,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי הילדים ברחבי המדינה טיפול בבעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).

הערה: הפרוטוקול מתואר בסדר כרונולוגי המתפרס במשך יומיים. השתמש ריאגנטים טרי כפי שמתואר בפרוטוקול להלן.

1. הכנת ריאגנטים ביום שלפני השיטת הזמן

  1. . מימה את מחסנית החיישנים
    1. דגירה 5 מ ל של הכייל (לוח חומרים) ב2 37 מעלות צלזיוס בחממה במשך הלילה.
    2. פתח את ערכת שיטת השטף (טבלת חומרים) והפרד את מחסנית החיישן (ירוק; למעלה) מלוח כלי השירות (שקוף; למטה). הבא, למקם את מחסנית חיישן הפוך וצמוד לצלחת השירות.
    3. באמצעות מים סטריליים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת החילוץ שלנו אפשרה לנו לקצור עד ~ 80,000 LSK HSPCs לכל עכבר. הכדאיות והמספרים של תאים LSK שופרו עם השיטה שלנו, כי אנחנו: (1) מח עצם משולב מגפיים העליון והתחתון, עצמות הירך, עצם החזה, צלעות כלוב, ועמוד השדרה, (2) נמנע באמצעות מאגר לפירוק התאים האדומים כי היה להגדיל את מוות התאים והשיא, ( השתמשו בצפיפות ההפרדה הבינונית של תאים מונו-נוקלאובטים, ו (4) נמנע באמצעות מאגר טרום מקורר שהיה גורם לאובדן תאים מעניינים במקבצים.

למרות ניתוח השטף מעמיק המשמש באופן מסורתי עבור תאים חסיד, השימוש שלנו ציפוי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו להדגים את הבידוד של כמות מקסימלית של האוכלוסייה הטהורה מורצק LSK הקיימא, כמו גם את המדידה של גליקוליזיס שלהם ואת הנשימה מיטוכונדריאלי עם מנתח השטף של מסחטות. באופן ספציפי, הפרוטוקול גובר על הנושאים הטכניים הבאים לשימוש ב-LSK HSPCs: i) התדר הנמוך של LSK HSPCs במוח עצם מוריין14, ii) פעילות מטבולית נמוכה בסיס של Lsk hspcs26, iii) שבריאת lsk hspcs27, ו-IV) ללא הדבקות של lsk hspcs לכלי התרבות15. בנוסף, יש לנו אופטימיזציה ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מהווה חלק בתמיכת המימון של המכון הלאומי לבריאות (HL131645, CA016058), קרן סנט בלדריק וקרן פליטוניה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.01% (w/v) תמיסת פולי-L-ליזיןSigmaP8920המשמשת לחיבור LSK
40 ומיקרו; מסננת תאים mפישר סיינטיפיק22-363-547משמש לסינון תאים לאחר ריסוק
אנטי ביוטין מיקרו-חרוזיםMiltenyi130-090-485משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה נגד עכבר CD45R/B220 שיבוט RA3-6B2BD Biosciences553086משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה נגד עכבר CD5 שיבוט 53-7.3BD Biosciences553019משמש עבור Lin- הפרדה
ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a שיבוט 53-6.7BD Biosciences553029משמש להפרדת קו
ביוטין חולדה נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C שיבוט RB6-8C5BD Biosciences553125משמש להפרדת פשתן
ביוטין חולדה אנטי-עכבר TER-119/תאי אריתרואיד שיבוט TER-119BD Biosciences553672משמש להפרדת קו
CD117 (c-Kit) נוגדן חד-שבטי (2B8), APCeBioscience17-1171-83משמש למיון LSK
Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםFalcon-Fischer Scientific14-959-53Aמשמש בבידוד תאים
Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםFalcon-Fischer Scientific14-432-22משמש בבידוד תאים
Falcon צינורות פוליפרופילן תחתונים עגוליםFalcon-Fischer Scientific14-959-11Aמשמש עבור מיון LSK
Fetal Bovine SerumNeuromicsFBS001-HIמשמש במאגר FACS
Histopaque-1083Sigma10831משמש להפרדת שיפוע ficoll
L-glutamine 100xFisher Scientific25-030-081משמש למדיית הבדיקה
LS ColumnMiltenyi130-042-401משמש להפרדת קו
Ly-6A/E (Sca-1) חד-שבטי נוגדן (D7), PE-Cyanine7eBioscience25-5981-82משמש למיון LSK
גורם תאי גזע עכברי (SCF)PeproTech250-03-100UGמשמש למדיית הבדיקה
תרומבופויטין עכברי (TPO)PeproTech315-14-100UGמשמש למדיית הבדיקה
PBS 1%Fisher ScientificSH3002802משמש למאגר FACS
פניצילין-סטרפטומיצין ( 10,000 U/mL)Fisher Scientific15140122משמש למדיית הבדיקה
Propidium IodideFisher ScientificP1304MPהמשמש למיון LSK
סוסון ים XFp תרבית תאים MiniplateAgilent Technologies103025-100משמש לזריעת LSK
נתרן פירובט (100 מ"מ)ThermoFisher11360070משמש למדיית הבדיקה
Streptavidin eFluor 450 מצומדeBioscience48-4317-82משמש למיון LSK
XF CalibrantAgilent Technologies100840-000משמש לאיזון מחסניות
XF מדיהAgilent Technologies103575-100משמש לבדיקת המדיה
XFp Glycolysis ערכת בדיקת מאמץAgilent Technologies103017100תרופות לבדיקת מאמץ גליקוליזה
XFp מיטוכונדריה ערכת בדיקת מאמץAgilent Technologies103010100תרופות לבדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי
מחסנית חיישן XFpAgilent Technologies103022-100משמשת לגליקוליזה ובדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי
עצם

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem Progenitor CellsMetabolic Respiration AnalysisGlycolysis MeasurementExtracellular Flux AnalysisBone Marrow IsolationMagnetic Cell SortingFlow CytometryOxygen Consumption RateExtracellular Acidification RatePLL Coated Wells

Related Articles