מולטי-סיב פונסה להקליט פעילות עצבית בבעלי חיים הנעים באופן חופשי

Summary

פרוטוקול זה מפרט כיצד ליישם ולבצע הקלטות מרובות סיבים, כיצד לתקן את הפריטים שאינם תלויים בסידן, ושיקולים חשובים עבור הדמיה צבעונית כפולה.

Abstract

הקלטת הפעילות של קבוצת נוירונים בחיה הנעה בחופשיות היא משימה מאתגרת. יתר על כן, כמו המוח הוא גזור קבוצות קטנות יותר תפקודית פונקציונלי, הוא הופך להיות הראשון להקליט מן התחזיות ו/או המוגדרים גנטית תת אוכלוסיות של נוירונים. בדרך-אגב, מדובר בגישה הנגישה ורבת עוצמה היכולה להתגבר על האתגרים הללו. על-ידי שילוב מתודולוגיות אופטיות וגנטיות, ניתן למדוד את הפעילות העצבית במבני מוח עמוקים על-ידי הבעת הבעת מחווני סידן מקודדים גנטית, אשר מתרגמים את הפעילות העצבית לאות אופטי שניתן למדוד בקלות. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הרכיבים של מערכת מרובת סיבים מולטי-סיב, כיצד לגשת למבני מוח עמוקים כדי לספק ולאסוף אור, שיטה לחשבון ממצאים התנועה, וכיצד לעבד ולנתח אותות פלורסנט. הפרוטוקול מפרט שיקולים ניסיוניים בעת ביצוע דימות צבע יחיד וכפול, מסיבים אופטיים בודדים או מרובים.

Introduction

היכולת להתאים תגובות עצביות עם היבטים ספציפיים של התנהגות בעל חיים הוא קריטי כדי להבין את התפקיד קבוצה מסוימת של נוירונים משחק בבימוי או להגיב לפעולה או גירוי. בהתחשב במורכבות של התנהגות בעלי חיים, עם מספר רב של מדינות פנימיות וגירויים חיצוניים שיכולים להשפיע אפילו על הפשוטה ביותר של הפעולות, הקלטת אות עם החלטה חד משפט החוקרים עם הכלים הדרושים כדי להתגבר על אלה גבלות.

סיבים פואביל הפך להיות טכניקה של בחירה עבור חוקרים רבים בתחום של מערכות מדעי המוח בגלל הפשטות היחסית שלה לעומת אחרים בטכניקות הקלטה vivo, היחס הגבוה שלה האות לרעש, ואת היכולת להקליט במגוון של , תבניות התנהגותיות^1,2

Protocol

כל הניסויים נעשו בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ובוועדות השימוש של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו, והמדריך הקנדי לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרו על ידי הגנת אוניברסיטת לאוול בעלי חיים וועדה.

1. יישור הנתיב האופטי בין מצלמת ה-CMOS (מוליך למחצה משלים מתכתי) לבין כבל התיקון הבודד או המסתעף

1. שחרר את כל הברגים על מתרגם 5 הצירים (11, איור 2ב).
2. בורג בכבל התיקון (12, איור 2B) למתאם [SMA (תת-מיניאטורי A) או FC (מחבר סיב אופטי)] המוצמדת למתרגם בן 5 הצירים.
3. הפעל את האור 470 ננומטר (1, איור 2B

Results

ההתנהגות העצבית של תגובות התנהגותיות יכולה להשתנות בהתאם למגוון גורמים. בדוגמה זו, השתמשנו vivo סיבים למדוד את הפעילות של מסופי אקסון מן האזור ההיפותלמי לרוחב (lha) כי לסיים habenula לרוחב (lha). עכברים סוג פראי הוזרקו עם וירוס הקשורים adeno (AAV) קידוד GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) ב LHA ו סיבים אופטיים הושתל עם הטיפ מיד מעל Lha (איור 4א). GCaMP6s ביטוי נמצא בגופי התא של lha ואת מסופי אקסון שלהם מקרין lha, שם אות סידן ניתן להקליט. ההפעלה של מסלול LHA-Lha מקדמת הימנעות פסיבית ב.......

Discussion

הסיבים האופטיים היא גישה נגישה המאפשרת לחוקרים להקליט בכמויות גדולות-סידן דינמיקה מתוך אוכלוסיות נוירואליות מוגדרות בעלי חיים הנעים בחופשיות. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות, כולל משימות "תנועה כבד" כגון בדיקות לשחות כפויה², פחד מיזוג¹⁸, אינטראקציות חברתיות^1,4, ואחרים^7, . ^{שמונה,19,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
בורג כובע נירוסטה 1/4 אינץ'-20, בורג כובע		SH25S100
1/4 אינץ'-20, בורג כובע נירוסטה ארוך 1/2 אינץ'		SH25S050
1/4 אינץ' -20 בורג כובע נירוסטה, 3/8 אינץ' Thorlabs ארוך		SH25S038
1000 ומיקרו; m, 0.50 NA, SMA-SMA כבל תיקון סיבים	Thorlabs	M59L01
12.7 מ"מ עמוד אופטי	Thorlabs	TR30/M
12.7 מ"מ מחזיק עמוד הדום	Thorlabs	PH20EM
15 V, 2.4 A יחידת ספק-כוח עם מחבר שקע 3.5 מ"מ עבור T-Cube	Thorlabs	KPS101
20x אובייקטיבי	Thorlabs	RMS20X	#10 באיור 2, #11 באיור 5
קוביית כלוב 30 מ"מ עם תושבת מסנן דיכרואית	Thorlabs	CM1-DCH/M	#8-9 באיור 2, #8-10 באיור 5
עדשות LED דוריות	405 ננומטר	CLED_405	#2 באיור 2
מסנן פס פס 410 ננומטר	Thorlabs	FB410-10	#5 באיור 2; #7 באיור 5
465 ננומטר.	עדשות LED Doric	CLED_465	#1 באיור 2
מסנן פס פס 470 ננומטר	Thorlabs	FB470-10	#4 באיור 2; #6 באיור 5
מסנן פס פס 560 ננומטר	Semrock	FF01-560/14-25	#5 באיור 5
עדשות LED דוריות	560 ננומטר	CLED_560	#1 באיור 3
תושבת קינמטית 5 צירים	Thorlabs	K5X1	#11 באיור 2, #12 באיור 5
Achromatic Doublet	Thorlabs	AC254-035-A-ML	#7 באיור 2
מתאם עבור 405 קולימטור	Thorlabs	AD11F	#3 באיור 2; #4 באיור 5
מתאם עבור קולימטור מתכוונן	Thorlabs	AD127-F	#3 באיור 2; #4 באיור 5
לוח לחם אלומיניום	Thorlabs	MB1824
מזלג הידוק	Thorlabs	CF125
מחבר קובייה	Thorlabs	CM1-CC
כפול 493/574 דיכרואי	Semrock	FF493/574-Di01-25x36	#10 באיור 5
מסנן פליטה עבור GCaMP6	Semrock	FF01-535/22-25	#6 באיור 2
מארז עם לוחות לוח קשיח שחור	Thorlabs	XE25C9
מכסה קצה עם הברגה SM1 חיצונית לעיבוד	מעבדות
מחזיק מסנן צינור עדשה SM1 לשינוי מהיר	Thorlabs	SM1QP	#4-6 באיור 2, #5-7 באיור 5
קולימטור קבוע עבור אור 405 ננומטר	Thorlabs	F671SMA-405	#3 באיור 2; #4 באיור 5
קולימטור קבוע עבור אור 470 ו-560 ננומטר	Thorlabs	F240SMA-532	#3 באיור 2; #4 באיור 5
מסנן פליטה ירוק	Semrock	FF01-520/ 35-25	במפצל קרן אור
ברזולוציה גבוהה USB 3.0 CMOS מצלמה	Thorlabs	DCC3260M	#13 באיור 2, #15 באיור 5
מפצל קרן אור	נוירופופוטומטריה	SPLIT	#14 באיור 5
מראה דיכרואית לונגפס, 425 ננומטר	חתך Thorlabs	DMLP425R	#8 באיור 2, #9 באיור 5
מראה דיכרואית לונגפס, 495 ננומטר חתך	סמרוק	FF495-Di03	#9 באיור 2, #8 באיור 5
מלט שיניים Metabond	C& B
M8 - כבל M8	עדשות דוריות	Cable_M8-M8
צינוריות סיבים אופטיים	עדשות		צריך לציין כי אלה ישמשו לניסויי פוטומטריה הדורשים חוטי תיקון סיבים אופטיים אוטופלואורסצנטיים נמוכים
	עדשות		צריך לציין כי אלה ישמשו לניסויי פוטומטריה הדורשים מסנן פליטה אדומה אוטופלואורסצנטי נמוך
	Semrock	FF01-600/37-25	במפצל קרן אור
T7 LabJack	LabJack
T-cube LED דרייבר	Thorlabs	LEDD1B
USB 3.0 כבל קלט/פלט, Hirose 25, עבור DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3