Summary
מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.
Abstract
הדינמיקה של פיתוח יכול להיות בעקבות מיקרוסקופ זמן הקפיצה של התהליך של העוברים חיים הטרנסגניים לחיות ביטוי של זריחה ברקמות או בתאים ספציפיים. קושי עם הדמיה של התפתחות העובר כולו הוא כי עוברי דגים לצמוח באופן משמעותי באורך. כאשר נטען באופן קבוע ב-0.3-1% ממיסים נמוך, מטילה הצמח מגבלות גידול, המובילות לעיוותים בגוף העובר הרך. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ לצניחה בזמן מיקוד, העובר חייב להיות ללא תנועה. מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועתיות העוברים ומאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים. כדי להדגים את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה התמונה בדגים טרנסגניים במשך 55 שעות רצופות. שיטה זו הרכבה ניתן להשתמש בקלות, בעלות נמוכה הדמיה של עוברי דג זברה שלמים באמצעות מיקרוסקופים הפוכה ללא דרישות של תבניות או ציוד מיוחד.
Introduction
הדג הגדול הינו אורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית, והמיקרוסקופיה היא השיטה העיקרית להמחיש את ההתפתחות העובלנית. יתרונות השימוש בעוברי דגים למחקרים התפתחותיים כוללים גודל קטן, בהירות אופטית, פיתוח מהיר ופוריות גבוהה של הדג המבוגר. הדור של הקווים הטרנסגניים המבטא זריחה ברקמות או תאים מסוימים אפשרו הדמיה ישירה של פיתוח רקמות בדרכים לא אפשרי עם בעלי חיים גדולים יותר בעלי חוליות. בשילוב עם מיקרוסקופ לשגות בזמן, פרטים ודינמיקה של פיתוח רקמות ניתן ללמוד בקלות.
קושי בהתפתחות הדמיה של דגי ההדמיה הוא שהעוברים גדלים באופן משמעותי באורך; העובר מרחיב את אורכו ארבע פעמים בתוך 3 הימים הראשונים של החיים1. גם, הגוף של העובר המוקדם הוא רך, ובקלות הופך להיות מעוות אם הצמיחה היא מוגבלת. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ ממוקד, העובר חייב להיות ללא תנועה. כדי לשמור על העוברים בעמדה קבועה עבור הדמיה זמן מיקוד התמונה, הם מורדם באופן קבוע ורכוב ב 0.3-1% נמוך להמיס. לדבר זה יש יתרון של התרת צמיחה מסוימת במהלך ההדמיה לתקופה מסויימת, תוך הגבלת תנועות העובר. חלקים של העובר יכול להיות ביעילות להיות בתמונה כך. עם זאת, בעת שימוש בשיטה זו עבור הדמיה של העובר כולו עבור פרקי זמן מורחבים, עיוותים הם נצפו בשל הצמיחה המוגבלת הנגרמת על ידי הצמח. לכן, נדרשות שיטות הרכבה אחרות. קאופמן ועמיתיו תיארו הרכבה חלופית של עוברי דג דג זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור, כגון מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (spim), על ידי הרכבה העוברים ב-fluorinated אתילן פרופילן (fep) צינורות המכילים ריכוזים נמוכים של agarose או מתילתאית2. טכניקה זו מייצרת ויזואליזציה מעולה של embryogenesis לאורך זמן. Schmid ואח ' לתאר הרכבה של עד שישה עוברים ב agarose בצינורות פבואר עבור מיקרוסקופ גיליון אור3 מתן ויזואליזציה של מספר עוברים במפגש אחד הדמיה. בתבניות נעשה שימוש כדי ליצור מערכי העובר להרכבה יעילה של מספר גדול יותר של עוברים4. מסקינקיות ואח ' בנויים בתבניות פלסטיק מודפס 3d שניתן להשתמש בהם כדי להפוך סיליקון מטיל כי העוברים בשלבים שונים ניתן להציב, המאפשר להרכבה בעמדה קבועה עבור הדמיה, כולל הדמיה קונפוקלית וקד5. הדפסה תלת-ממדית השתמשה גם כדי ליצור תבניות עבור מיקום עקבי של עוברי צבפיש 96-ובכן פורמט6. תבניות מסוימות מותאמות אישית עבור שלבים מסוימים ולא ניתן להתיר צמיחה בלתי מוגבלת לפרקי זמן ארוכים, בעוד שתבניות אחרות גמישות יותר. לאחרונה, Weijts ואח ' פרסמה את העיצוב והייצור של מאכל ארבע היטב עבור הדמיה חיה של עוברי דגיםשבעה 7. בתבשיל זה, הזנב והגזע של עוברי דגים מורדם ממוקמים באופן ידני תחת גג סיליקון ברור מחובר ממש מעל זכוכית כיסוי כדי ליצור כיס. העובר הוא תוקן לאחר מכן במיקום זה על ידי תוספת של 0.4% agarose. הרכבה זו מאפשרת הדמיה של החלק האחורי של כ 2 מ"מ (העורק והזנב) של העובר, וכמו עד 12 עוברים ניתן לרכוב לכל טוב, השיטה מאפשרת הדמיה של דגימות מרובות. באופן דומה, הירסינגר ו סטבנטון הציגו לאחרונה שיטה שבה ראש הדג מותקן בתוך agarose, בעוד הזנב יכול לצמוח בחופשיות, ושיטה זו גם מקלה ביעילות הדמיה של הגזע והזנב של העובר8.
מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועות העוברים תוך התרת צמיחה בלתי מוגבלת. היתרונות של שיטה זו הרכבה הם כי היא בעלות נמוכה, שיטה מהירה וקל לעלות על העוברים של שלבים שונים עבור הדמיה באמצעות כל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מאפשרת הדמיה ארוכת טווח של הגוף כולו (ראש, גזע וזנב) במהלך התפתחות העובר. כדי להציג את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה מתמונה בדגים טרנסגניים. שני עוברים בכל הפעלה, בשני אורכי גל תלת-ממד הוצגו על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות עבור 55 שעות רצופות כדי להפוך סרטים של פיתוח רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עבודת החיות המוצגת כאן אושרה על ידי הטיפול המוסדי בעלי חיים וועדות השימוש (IACUCs) של אוניברסיטת יוסטון ואוניברסיטת אינדיאנה.
1. גידול דגים
הערה: עבודה עם דגמי בעלי חוליות דורשת פרוטוקול מאושר IACUC. היא צריכה להתבצע על פי ההנחיות הלאומיות והבינלאומיות הרלוונטיות.
- שמירה על דגי מבוגרים כמתואר בספרות9בעבר.
- בשעות אחר הצהריים, במקום מבוגר. מזדגים במיכלי רבייה מתרבים זכרים לנקבות ביחס של 1:2.
2. הכנת פתרונות
- הפוך פתרון מניות של 1% להמיס ממיסים נמוכה באמצעי תקשורת העובר (E3:5 מ"מ הנאגל, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 Mm MgSO4, מותאם ל-pH 7.0). מחלקים את פתרון המניה לצינורות 1.5 mL ומאחסנים אותם ב -4 ° c.
- הפוך פתרון מניות של 4% (w/v) Tricaine (MS-222) במים מזוקקים. חנות ב -4 ° c בבקבוק כהה.
התראה: Tricaine רעיל ויש לשקול ולהתפרק בתוך מכסה המנוע. - הפוך פתרון מניות של 20 מ"מ N-פנילתיואוראה (PTU) במים מזוקקים. חנות ב-20 ° c.
3. הכנת העוברים
- לאחר ההזדווגות, עוברי הקציר ב-E3 בצלחת פטרי ומודחת אותם ב 26.5 ° c עבור כ 28 h לפני הטעינה.
הערה: זה מאט את ההתפתחות של העוברים כך העוברים הם כ 30 הבמה הסומטים בתחילת ההדמיה. - עוברים מורדם ב-0.016-0.020% Tricaine ב-E3. כדי לעכב את הפיגמנטציה, הוסף PTU לריכוז של 200 μM.
- העוברים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ מבתר. שימוש בשני מלקחיים, אחיזה ומשוך בעדינות את הצ בנפרד כדי לשחרר את העובר.
4. הרכבה בתוך הצמח
הערה: שיטת ההרכבה המפותחת מחייבת שני ריכוזים שונים של מחסור במיסים בשנת E3 עם 0.02% Tricaine ו-PTU לפי הצורך. הפתרון הראשון מכיל ריכוז מיטבי של הצמח שבו מינימום העיוות והתנועתיות. האופטימיזציה מתוארת בשלב 5 להלן.
- מחממים את הפתרונות האגתיים לשתי השכבות (ריכוז המוגדר בשלב 5 למטה ו -1%) עד 65 ° c. תנו לאגקם להתקרר כ-30 ° צ' בדיוק לפני הטעינה, כך שהוא לא ייפגע מהחום. להרכבה, השתמש במנות בתחתית זכוכית של 35 מ"מ עם תחתית זכוכית מס ' 0. זכוכית העטיפה המצורפת לתחתית המנה יוצרת 10 מ"מ רדוד (כ-1.2 מ"מ עמוק) ובכן, שבו יש להציב את העובר.
הערה: במקרה זה, הריכוז עם התנועתיות והעיוותים הפחותים בין 0.025 ל-0.040% התעוררה. - הנח בעדינות על העובר התחתון עם אחד הצדדים הצדדיים שלו לקראת תחתית המנה באמצעות פיפטה זכוכית או מיקרופיפטה. אם נשתמש במיקרופיפטה, חותכים את החלק החיצוני של הקצה כדי להגדיל את גודל הפתח כדי להתאים לעובר (איור 1א). הסר בזהירות את הE3 שנותרה עם מיקרופיפטה.
- הוסף את הפתרון הראשון שנוצר על ידי הזכוכית המכסה המצורפת לתחתית המנה כדי לכסות את העובר (שכבה 1) (איור 1B). ודא כי ה-agarose מכסה את הבאר הקטנה, אך לא גולש אותו.
- כסו את הבאר הקטנה עם זכוכית כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ) (איור 1ג) כדי ליצור חלל צר מלא עם העובר בין שתי כוסות הכיסוי.
- מניחים שכבה של 1% הפתרון על גבי הזכוכית המכסה בכל החלק התחתון של המנה (שכבה 2) (איור 1ד). כפי ששכבה זו מתקשה, הוא מחזיק את הזכוכית המכסה במקום.
- למלא את החלק הנותר של המנה עם E3 המכיל 0.02% Tricaine כדי לשמור על המערכת להתייבש (שכבה 3) (איור 1E).
הערה: בכיוונון זה, זכוכית העטיפה ו-1% agarose להגן על השכבה התחתונה מלקבל מדולל.
5. אופטימיזציה של הפתרון הראשון עבור שכבה 1
- כדי לזהות את הריכוז האופטימלי של הצמח עבור שכבה 1, השתמש בגישה לחיפוש ברשת בקנה מידה רב. העוברים הר בריכוזים גוברת של agarose החל 0.01% אל 1% ואחריו לפקיעה זמן הדמיה של הגבלת גידול העובר ותנועתיות בשדה הראייה. זהה את הריכוזים שבהם העיוות והתנועתיות הם מינימום.
- כדי לייעל את הריכוז של agarose עוד, הר העוברים באמצעות מגוון עדין של ריכוזים של agarose (למשל, בין 0.025 ו 0.040% agarose) בהתאם לריכוז נמצא להיות הטוב ביותר בשלב 5.1 (למשל, 0.025%, 0.028%, 0.031%, וכו ').
הערה: במעבדה שלנו, הריכוז האופטימלי ביותר היה בסביבות 0.03%.
6. הזמן לפקיעה הדמיה
הערה: שיטת הרכבה זו פועלת עבור כל מיקרוסקופ הפוך עם פונקציונליות לפקיעה זמן עבור הדמיה של שדות פלואורסצנטית ובהיר.
- לבצע הדמיה זמן לפקיעה עבור העובר כולו או חלקים ממנו עד 55 h. עבור הדמיה של מספר עוברים, השתמש במתאם שלב המכיל מספר מנות עם עובר אחד רכוב לכל מנה. סובב את הכלים אחד אחרי השני כך שעוברי האורך יהיו בערך אופקית כפי שנקבע בעין. לצמיחת העובר והפיתוח האופטימליים, השתמשו בשלבי מיקרוסקופ עם אינקובטור שהוגדר ב-28.5 ° c.
- בחרו מטרת הגדלה נמוכה בתוכנת המיקרוסקופ. תחת העין, לאתר וליישר דק את העוברים אופקית על ידי סיבוב הכלים באמצעות תאורה בהירה בשדה ולהקליט את מיקומם בתוכנה. צור שם קובץ לצורך שמירה אוטומטית של הנתונים.
הערה: בניסוי זה, תוכנית apo λ 4x 0.2 NA מטרה ו- XY tab בתוך חלון הרכישה הND שימשו כדי להקליט את מיקומי העוברים. הנתונים נשמרו בתבנית. nd2. המטרה נבחרה על ידי לחיצה על הסמלים שלה בכרטיסיה משטח Ti . - הגדר את גודל הנקב, מהירות הסריקה, גודל התמונה והזום. לאחר מכן, בחרו מטרת הגדלה גבוהה יותר ללכידת התמונות.
הערה: בניסוי זה, תוכנית-apo 10x 0.45 NA מטרה שימש לדימות של עוברים שלמים, ו-super-fluor 20 x 0.75 NA מטרה שימש הדמיה הגדלה גבוהה יותר של חלקים של העובר. חריר הוגדר 1.2 AU (19.2 יקרומטר עבור עדשת 10x), מהירות הסריקה הוגדרה עבור פיקסל זמן לשכון של 2.4 μs ואת גודל התמונה היה מוגדר 1024 x 1024 פיקסלים עם זום סריקה של אחד, מתן גודל פיקסל של 1.24 יקרומטר עבור עדשת 10x ו 0.62 יקרומטר עבור עדשת 20x. - בחר את הערוצים ליצירת תמונה של הקרינה הפלואורסצנטית. כוונן את הגדרות לכידת התמונה בערוץ אחד בכל פעם. עבור כל ערוץ פלואורסצנטית להתאים את כוח הלייזר ואת המתח הגבוה גלאי, ומוודאים לאסוף את הטווח הדינמי הטוב ביותר האפשרי תוך הימנעות הרוויה והגבלת photobleaching לבנה.
הערה: בניסוי זה, gfp היה התמונה עם הערוץ 488 ירוק, (488 ננומטר לייזר ופליטה בין 500 ו 550 nm), ו rfp עם ערוץ אדום 561 (561 nm לייזר ופליטה בין 570 ו-600 nm), ואת תמונת השידור נאסף באמצעות הלייזר לייזר nm וגלאי אור המשודר (TD ערוץ). - כדי לדמות את העובר כולו עם המטרה 10x, תמונה מספר שדות של תצוגה עם חפיפה ולתפור אותם יחד באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
הערה: כאשר העוברים יגדלו במידה ניכרת במהלך ההדמיה, ודא שיש מקום בשדה הראייה הקדמי והאחורי של העובר. השתמש בכרטיסייה ' סרוק תמונה גדולה ' של חלון הרכישה הND ובחר תבנית 4 x 1 עם חפיפה של 10% ללכידת ארבעה שדות תצוגה סמוכים. - הגדר את ההגדרות עבור לכידת Z-ערימות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
הערה: מכיוון שהעובר מותקן קרוב לתחתית צלחת הזכוכית, המרכז שלה יזוז מלמטה כפי שהוא צומח. השתמש בכרטיסייה Z של חלון הרכישה הND ובחר בטווח היחסי הסימטרי. בשיטה זו, מישור המיקוד הנוכחי משמש כמישור הייחוס ושאר המטוסים מסימטרית לעיל ולמטה כדי לכלול את העובר כולו בתוך אמצעי האחסון של מחסנית Z, עם מספיק מקום כדי לחשבון את צמיחת הדגימה. בכל הניסויים, המרווח הוגדר עד 11 יקרומטר ואת הטווח הכולל על 45 מטוסים. - כדי לשמור על ההתמקדות של עוברים מרובים במהלך הדמיה לטווח ארוך זמן, השתמש בפוקוס אוטומטי. אם הדמיה של מספר עוברים, התאם את רמות ההיסט הבודדות עבור כל עובר כדי להתמקד במישור הייחוס.
הערה: בניסוי זה, נעשה שימוש במערכת ייצוב מיקוד המבוססת על לייזר. - הגדרת פרמטרים לפקיעה זמן בתוכנת המיקרוסקופ ובתמונה למשך של 55 h בסביבות 1 h במרווחי זמן. בכל מחזור, לכוד שני מערכי נתונים של העובר ברציפות ושמור נתונים באופן אוטומטי לאחר כל מחזור.
- עיבוד תמונות באמצעות גירסה מקוונת או מבוטלת של תוכנת המיקרוסקופ. אם יותר מעובר אחד היה בתמונה, צור קבצים עצמאיים עבור כל עובר על-ידי פיצול ערכת הנתונים בהתבסס על מיקום ההדמיה. השתמש בתחזיות אינטנסיביות מרביות או בכלי דומה כדי להמיר ערכות נתוני זמן תלת-ממד לערכות נתונים של זמן דו-ממדי. צרו קובצי סרטים בעזרת האפשרות ' שמור כתפריט ', בחירה ב-. avi כתבנית הקובץ. בחר באפשרות ללא דחיסה עם 200 ms מרווחי זמן עבור מהירות השמעה של 5 מסגרות/s.
הערה: ערכת הנתונים המקורית של שני עוברים בניסוי זה היתה מפוצלת באמצעות מיקומי פיצול פונקציה בתוכנה (קובץ | ייבוא/ייצוא | פיצול מרובה נקודות). ערכות נתונים בזמן תלת-ממד הומרו לערכות נתוני זמן דו-ממדי באמצעות הפונקציה הקרנת עוצמה מרבית (תמונה | ND עיבוד | יצירת תמונת הקרנה בעוצמה מרבית ב-Z).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח שיטת ההרכבה
המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה לפתח טכניקת הרכבה בעלות נמוכה להדמיה בזמן הדמיה של התפתחות הדגים במשך פרקי זמן ארוכים. שיטת ההרכבה שכבתית פותחה כדי לאפשר צמיחה מלאה של גוף העובר שברירי דג זברה, תוך הגבלת תנועותיו. אם ריכוז השכבה 1 גבוה מדי, העוברים יהפכו להיות מעוותים ומעוקלים (איור 2). עוברים שגדלו ב 0.1% ו 0.5% agarose יש זנבות מקוצר, סנפירים מעוותת, וראשים מעוקלים. להיפך, אם הריכוז הגובר נמוך מדי, העוברים זזים משדה הראיה בזמן מיקרוסקופ מועד היום, אף על פי שהם מורדם, כאשר הזנב הגדל מניף מהגוף העובר וגורם לו לנוע. בידינו, הריכוז האופטימלי ביותר בין 0.028% ל-0.034% התעוררה בין אצוות שונות של הצמח. הרכבה מתחת 0.025% agarose לא מספקת מספיק עמידות לעובר להישאר בשדה הראייה.
הדמיה בזמן ממושך לדימות של כלי דם, התפתחות עצבית ושרירים
לאחר אופטימיזציה של שיטת ההרכבה שתוארה לעיל, הזמן פקיעה תמונות מיקרוסקופית הקונסקופיה שנתפסו על פני טווח של 55 h. אנו התמונות בשידור חי הטרנסגניים במבטא GFP או RFP ברקמות שונות. היתרון של שימוש בדגים טרנסגניים עם זריחה אנדודוגני עבור הדמיה הזמן לפקיעה היא כי מולקולות פלואורסצנטית, כגון GFP ו RFP, מיוצרים ברציפות העובר חי, ולכן, זה לא בקלות צילום אקונומיקה. ראשית, עוברים של צלב Tg (kdr1: EGFP) mitfab692/b69210 ו -ubi-זבראאו11 היתה תמונה. בעוברים אלה, RFP מתבטא בכל התאים של העובר, אשר מאפשר ויזואליזציה של מבנה העובר הכללי. GFP מתבטא בתאי האנדותל של הvasקולטורה. עוברים הטרנסגניים כפולים הדמיה עבור 55 שעות מ כ 30 השלב הסומטים כדי להמחיש את התפתחות כלי הדם בראש ובגוף (איור 3 המשלים סרט S1) באמצעות מטרה 10X עם 0.45 NA. שני עוברים/הפעלה היו מהתמונה עם z-ערימות והפקיעה זמן בלולאה כך שלאחר הדמיה העובר הראשון בשני אורכי גל שונים, השני היה לאחר מכן התמונה השנייה ולאחר מכן הראשון שוב. איור 3 מציג את לבלוב הספינה הבין-משנית (ISV), פיתוח כלי מעיים משנה ומקלעת בראש, ולאחר מכן לעיבוי ורידים ביחד עם סיומת העורק. הדמיה של העובר כולו עם ואצלב מראה כי לבלוב ISV מתחיל בין הסומתים וגדל דורסלי עד לנקודה של הצינור העצבי, שבו Isv לוקח נתיב שונה ונבטים בכיוון אל הגבול הקדמי הקודם הבא.
לאחר מכן, עוברים של הצלב Tg (mnx: GFP) mitfab692/B629 ו -ubi-zebrabow היו הדמיה במשך 55 שעות בערך 30 השלב הsomite כדי להמחיש את התפתחות תא העצב מוטורי (איור 4 ו- S2 סרט משלים). Tg (mnx: GFP) היה הראשון חצה mitfab692/B692 (שניהם Zebrafish הבינלאומי משאבים מרכז באוניברסיטת אורגון, OR) כדי לייצר TG(mnx: gfp) mitfab692/b629. מעבר לסוענים. לעבר הצד הגחוני של העובר בניגוד לכלי הקיבול שנבט בין הסומלים, האקסונים נבט מעל האמצע מעל המבנה שנוצר משברון. הנביטה מתחיל לכיוון הקצה הקדמי של הצינור העצבי, בזווית ישרה מהצינור העצבי, ומתפשט האחורי. על ידי ממשק somite/חלמון, לבלוב משנה כיוון לבלוב הקדמי והאחורי. שים לב לאינבציה של הלב המתפתח בידי הנמוריטים הקדמי.
גם, עוברים של הצלב Tg (kdr: enl. memRFP) mitfab692/b692 (הצלב של tg (kdr: Enl. מmrfp ו Mitfab692/B692) ו Tg (mnx: gfp) mitfab692/b692 היו תמונות. בעוברים לשעבר, הזריחה אדום הדם לא היה גלוי עד 36 שעות לאחר הפריה (hpf), ולכן התחלנו את ההדמיה בשלב מאוחר יותר ב 2 dpf. אנו התמונה של חלק מהגזע, דורסלי אל הסיומת שק החלמון, באמצעות הגדלה גבוהה יותר (20x המטרה). סרט זה מראה כי העוברים שכבו עדיין מספיק עבור איכות הדמיה טובה בהגדלה גבוהה יותר. הפיתוח המשותף של לבלוב העצב העצמי ביחס לעמדת הכלים הבינסליים הופעלו (איור 5 ומשלים הסרט S3). בסרטים אלה, הפרטים הטובים יותר של הלבלוב הגפתונים נראים לעין, כמו גם לבלוב מתחת לפני הצינורית העצבית ועד לנקודה שבה האקרונים העצביים והכלים הבינסליים עוברים במשותף. העיבוי מקלעת הווריד. גם מוצג בבירור שים לב כי כמו נבט neurite חסר לכיוון הקצה האחורי של הזנב (במיקום של 12th neurite מהצד הימני), העצב האחורי הקרוב ביותר משתרע לעבר החלק הקדמי של העובר לכסות את האזור בין neurites 11 ו -13.
לבסוף, מכלאה של HGn39b12,13 ו -ubi-זבראאו היתה בתמונה. HGn39b הוא קו ztrap עם להוסיף gfp בactivator של חלבון הלם חום ATPase הומולוג 1 (AHA1) גן (http://kawakami.lab.nig.ac.jp/) וזה מבטא gfp בשרירי הסומנים (איור 6 ו- S4 סרט המשלים). ככל שמספרים מגדילים את הגידול, גם הסומטים מתרחבים באורך וברוחב. הסרט הזה גם מראה יפה התפתחות לב של קרינה פלואורסצנטית אדום מתוך קו הדגים Ubi-זבראאו .
איור 1: תיאור שיטת ההרכבה. (א) להוסיף את העובר בדגים דג זברה קטן שנוצר על ידי התחתון זכוכית בצלחת 35 mm. (ב) להוסיף שכבת agarose 1 אל הבאר הקטנה כדי לכסות את העובר. (ג) הציבו בזהירות זכוכית מכסה על הבאר הקטנה. (ד) להוסיף שכבה agarose 2 על החלק התחתון של המנה 35 mm. (ה) הוסף E3 למנה. (ו) שרטוט סכמטי של חתך רוחב של ההרכבה הוגדרה. (G) מיקרוסקופ התמונה (המטרה 5x) של העובר דג דג זברה הסופי מצרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגבלת גידול העובר ועיכוב התפתחותי בריכוזים שונים של הצמח. העוברים נטענו בריכוזים שונים של הגדלים ובגודלם ובפיתוח התמונה ב-48 hpf. תמונות שנתפסו על ידי מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית צבע מיקרוסקופ (2.5 x המטרה) ואת תוכנת המיקרוסקופ הנלווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ויזואליזציה של התפתחות הvasקולטורה. הצלב של Tg (kdr1: egfp) mitfab692/b692 ו -ubi-zeבראקוב התמונה מתוך כ 30 הבמה הsomite עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. ואסיקובלטורה בירוק וכל התאים האחרים באדום. סרגל קנה מידה 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ויזואליזציה של התפתחות הנוירונים והneurite לבלוב. הצלב של Tg (mnx: gfp) mitfab692/b629 ו -ubi-zeבראקוב לתמונה מתוך כ 30 הבמה הsomite עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. , נוירונים מוטורי בירוק. כל התאים האחרים באדום סרגל קנה מידה 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה של הפיתוח המשותף של הנוירונים והקובלטורה. הצלב של Tg (kdr: enl. memrfp) mitfab692/b692 ו Tg (mnx: gfp) mitfab692/b692 תמונה עבור 55 שעות מ כ 2 dpf על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. , ואסקובלטורה באדום. נוירונים מוטורי בירוק סרגל קנה מידה 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ויזואליזציה של ביטוי GFP שרירים ב מסוענים. הצלב של HGn39b ו ubi-ze ow היו בתמונה על מיקרוסקופ מיקוד עבור 55 h מ כ 30 השלב הסומטים. , שריר בירוק. כל שאר התאים באדום סרגל בקנה מידה 500 יקרומטר לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט משלים S1: הסרט של העובר של הכלאה של Tg (kdr1: egfp) mitfab692/b692 ו -ubi-ze ow מתוך כ 30 הבמה somite עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות מטרה 10x. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרט משלים S2: הסרט של העובר של הכלאה של Tg (mnx: gfp) mitfab692/b629 ו -ubi-zeבראקוב מחקה מ כ 30 הבמה הsomite עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות מטרה 10x. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרט משלים S3: סרט של העובר של הצלב Tg (kdr: enl. memrfp) mitfab692/b692 ו Tg (mnx: gfp) mitfab692/b692 תמונה מ כ 2 dpf עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות מטרה 20x. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרט המשלים S4: הסרט של העובר של הצלב של HGn39b ו -ubi-ze ow מתוך כ 30 הבמה הsomite עבור 55 h על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד באמצעות מטרה 10x. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת הרכבה עבור מיקרוסקופיה מורחבת של מיקרוסקופית הזמן של עוברי הדגים השלם מתוארת כאן. הצעד הקריטי ביותר עבור שיטת ההרכבה היא לזהות את הריכוז האופטימלי של agarose כי יאפשר צמיחה בלתי מוגבלת של העובר, ובאותו זמן לשמור על העוברים בעמדה קבועה לחלוטין עבור הדמיה קונפוקלית וקד. מכיוון שהריכוז האופטימלי של העולה הוא צר מאוד, ערך זה רגיש מאוד לשגיאות במדידה של משקל העולה ונפח של E3 במהלך הכנת הפתרון. הריכוז האופטימלי עשוי גם להיות תלוי בטמפרטורה ובשלב של העובר. כך, הריכוז האופטימלי יהיה צורך להגדיר מחדש עבור כל קבוצה חדשה של פתרון agarose באמצעות חזרה על מבחנים של ריכוזים שונים.
שלב קריטי נוסף נמצא בשיטת ההרכבה היא התוספת של השכבה השנייה של הצמח. השכבה השנייה מחזיקה את הזכוכית המכסה במקומה. יש להוסיף אותו בזהירות למנה מעט בכל פעם, כך שהיא אינה גורמת לזכוכית המכסה לזוז. השכבה השנייה משמשת גם כמכשול חדיר עבור E3. ללא E3, העוברים יתייבשו במהלך ההדמיה. ללא השכבה השנייה של הצמח, הזכוכית המכסה והעובר יתחילו לרחף.
מגבלה של שיטת ההרכבה המוצעת היא כי בעוד הוא פועל היטב עבור מיקרוסקופים הפוכה, זה לא עובד עבור מיקרוסקופים זקופה. כמה ניסיונות נעשו כדי לבצע הדמיה בזמן ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ זקוף, על ידי מילוי הצלחת בתחתית הזכוכית עם E3, איטום אותו עם parafilm, ולהפוך אותו הפוך. עם זאת, לעתים קרובות התוצאה היא כי ההרכבה קרסה באמצע ההדמיה. זה יכול להיגרם על ידי חום מוגבר במדגם לאחר חשיפה ארוכה לאור לייזר, מה שגורם השכבה מתחזק להמיס.
העוברים החלו להראות. בצקת לרקמת הלב משתנה בין ניסויים שונים, בצקת נצפתה בין 35 ל-50 שעות של דימות. בין אם זה נגרם על ידי העובר או השפעת הרדמה, לא ידוע כרגע. Tricaine ידוע לדכא את כיווץ שרירי השלד והשרירים. כתוצאה מכך, טריקיין משפיע על קצב הלב בדגים בוגרים14 ועוברי15. מחקרים אחרים דיווחו גם כי הטיפול בטריקיין גורם בצקת באמצעות הלב של העוברים בזיברפיש2,16. במאמר זה, ריכוז של Tricaine (0.016-0.020%) בשימוש נפוץ במחקר דג זברה; עדיין, בצקת החוגה התרחשה בסוף תקופת ההדמיה. בצקת ברקמת הלב היתה הגבלה עיקרית להפעלת העוברים לאורך זמן. הדרכים הפוטנציאליות להפחתת רעילות הלב משלבות שתי הרדמה שונות, כגון Tricaine עם אאונול, או שימוש ב-α-bungarotoxin הזרקת mRNA להרדמה16; השפעות מועילות של תרכובות ההרדמה קומבינטורית או חלופית צריך להיות נחקר נוספת עבור הדמיה ממושכת זמן לפקיעה של התפתחות דג דג זברה.
לסיכום, שיטת ההרכבה המתוארת היא מהירה, קלה, חסכונית ועובדת על כל מיקרוסקופ הפוך. ניתן להשתמש בכלים התחתונים הרגילים ובמנות נמוכות של התכה, ואין צורך בתבניות מיוחדות, ציוד או מכשור. שיטת ההרכבה בשכבות מאפשרת צמיחת העובר בעת ובעונה אחת, תוך שמירה על העוברים במצב קבוע. באמצעות המורחבת זמן הדמיה של האורגניזם המלא ידע חדש של פיתוח רקמות ניתן להשיג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לאלברט פן ולארגו סיאיקמן על מתנות של דגי הטרנסגניים. אנו מודים לקואיצ'י קסטאמי במכון הלאומי לגנטיקה, פרויקט BioResource הלאומי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן עבור מתנת הHGn39bהטרנסגניים. כמו כן, אנו מודים לפטימה מרצ ולקתלין גאייבסקי לסיוע במיקרוסקופיה וטרייסי ת'ייולט לתצלומים.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי למדעי הסביבה של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר P30ES023512 וחוזה מספר HHSN273201500010C). SU נתמך על ידי מחבר מהתוכנית Keck בביולוגיה סרטן התוכנית (מפרץ החוף קונסורציומים CPRIT גרנט RP140113) ועל ידי רועי הקרן הקרנות. J-Å G נתמכת על ידי הקרן רוברט א. וולש (E-0004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
