この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。
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この記事について
サマリー
要約
発達のダイナミクスは、特定の組織または細胞において蛍光を発現する生きているトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の共焦点タイムラプス顕微鏡法に続くことができる。全胚のイメージングの難しさは、ゼブラフィッシュ胚が実質的に長くなるということです。0.3~1%低溶融アガロースに定期的に取り付けられると、アガロースは成長制限を課し、軟胚体の歪みにつながります。しかし、共焦点タイムラプス顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。この記事では、無制限の成長を可能にしながら胚の運動性を制限するゼブラフィッシュ胚の層状取り付け方法について説明します。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。この方法のユーザビリティを実証するために、全胚血管、神経および筋肉の発達を55時間連続してトランスジェニック魚に画像化した。この取り付け方法は、金型や特殊装置の要件なしに、反転顕微鏡を使用してゼブラフィッシュ胚全体を簡単かつ低コストでイメージングするために使用できます。
概要
ゼブラフィッシュは長い間発達生物学のモデル生物であり、顕微鏡検査は胚発生を可視化する主要な方法である。発達研究のためにゼブラフィッシュ胚を使用する利点は、小さなサイズ、光学的明瞭さ、急速な発達、および成虫魚の高い胎児性を含む。特定の組織または細胞で蛍光を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインの生成は、より大きな脊椎動物では不可能な方法で組織の発達を直接可視化することを可能にした。タイムラプス顕微鏡と組み合わせることで、組織現像の詳細とダイナミクスを容易に研究することができる。
ゼブラフィッシュのイメージングの難しさは、胚が実質的に長くなるということです。胚は、寿命の最初の3日以内にその長さを4回延長します。また、初期胚の体は柔らかく、成長が制限されると歪みやすくなります。しかし、共焦点顕微鏡を行うには、胚を固定化する必要があります。胚を共焦点タイムラプスイメージングの固定位置に保つために、定期的に麻酔を行い、0.3~1%の低溶融アガロースに取り付けます。これは、胚の動きを制限しながら、一定期間のイメージング中にいくつかの成長を可能にするという利点を有する。胚の一部はこのように効率的に画像化することができる。しかし、この方法を長期間胚全体のイメージングに用いる場合、アガロースによる成長制限により歪みが見られる。したがって、他の取り付け方法が必要です。カウフマンたちは、無濃度のアガロースまたはメチルセルロース
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プロトコル
ここで発表された動物の仕事は、ヒューストン大学とインディアナ大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 魚の夫
注: 脊椎動物モデルの操作には、IACUC 承認プロトコルが必要です。これは、関連する国内および国際的なガイドラインに従って行われるべきです。
- 以前に出版された文献9で説明されているように、成虫ゼブラフィッシュを維持する。
- 午後は、繁殖タンクに大人のゼブラフィッシュを置きます。1:2の比率でメスにオスを繁殖させる。
2. ソリューションの作成
- 胚媒体中の1%低溶融アガロースのストック溶液を作る(E3:5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl 2、0.33 mM MgSO4、pH7.0に調整)。1.5 mLチューブに原液をアリコートし、4°Cで保存します。
- 蒸留水中で4%(w/v)トリカイン(MS-222)の原液を作ります。暗いボトルに4°Cで保管してください。
注意:トリカインは有毒であり、計量し、ヒュームフードに溶解する必要があります。 - 蒸留水中で20 mM N-フェニルチウラ(PTU)....
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結果
取り付け方法の開発
この研究の主な目的は、ゼブラフィッシュ開発のタイムラプスイメージングのための低コストの取り付け技術を長期間開発することでした。層状取り付け方法は、その動きを制限しながら、脆弱なゼブラフィッシュ胚体の完全な成長を可能にするために開発されました。層1のアガロース濃度が高すぎると、胚が歪んで湾曲します(図2)。0.1%と0.5%のアガロースで成長した胚は、尾を短くし、フィンを歪ませ、湾曲した頭部を持っています。逆に、アガロース濃度が低すぎると、成長する尾が胚体から振れ出て動くように、麻酔されても、時間経過顕微鏡の間に胚は視野外に移動する。私たちの手では、最適なアガロース濃度は、アガロースの異なるバッチ間で0.028%と0.034%アガロースの間で変化しました。0.025%アガロース以下の取り付けは、胚が視野にとどまるのに十分な抵抗を提供しなかった。
血管、神経細胞および筋肉の発達の延長タイムラプスイメージング
上述した取り付け方法.......
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ディスカッション
ここでは、ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡検査の取り付け方法について説明する。取り付け方法の最も重要なステップは、無制限のゼブラフィッシュ胚の成長を可能にするアガロースの最適な濃度を特定すると同時に、共焦点イメージングのために胚を完全に固定された位置に保つことです。アガロースの最適濃度は非常に狭いため、この値は、溶液の調製中にアガロースの重量とE3の体積の測定における誤差に非常に敏感である。最適な濃度はまた、胚の温度および段階に依存し得る。したがって、最適な濃度は、異なる濃度のテストの繰り返しを通じて、アガロース溶液の新しいバッチごとに再定義する必要があります。
もう一つの重要なステップは、アガロースの第2層の添加である取り付け方法である。2番目の層はカバーガラスを所定の場所に保持する。カバーガラスが動かないように、少しずつ丁寧に加えなければなりません。第2の層はまた、E3の透過性バリアとして機能する。E3がなければ、胚はイメージング中に乾燥する。アガロースの第2層がなければ、カバーガラスと胚が浮遊し始めます。
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開示事項
著者たちは何も開示する必要はない。
謝辞
トランスジェニックな魚の贈り物に対してアルバート・パンとアルント・ジークマンに感謝します。国立遺伝学研究所の川上浩一氏に感謝します。 また、ファティマ・マーチャントとキャスリーン・ガジェフスキの共焦点顕微鏡検査への支援、写真のトレーシー・テリオー
この研究は、国立衛生研究所環境衛生研究所(助成金番号P30ES023512および契約番号HHSN273201500010C)からの助成金によって支援されました。SUは、ケック計算癌生物学プログラム(湾岸コンソーシアムCPRIT助成金RP140113)とヒュー・ロイとリリー・エンダウメント基金のフェローシップによって支援されました。J-Å Gはロバート・A・ウェルチ財団(E-0004)の支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 低融点アガロース | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | 溶解した溶液を4°Cで保存します。C |
| 35 mm ガラス底皿、0 番カバースリップ、ガラス底直径 10 mm | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | 溶解溶液を 4 °C で保存します。C |
| N-フェニルチオ尿素 (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | 溶解液を-20°Cで保存してください。C |
| マイクロカバーガラス 22x22 mm | VWR | 48366 067 | |
| ライカ DMi8 蛍光顕微鏡 | ライカ | NA | |
| LAS X ソフトウェア | ライカ | NA | 顕微鏡ソフトウェア |
| DMC4500 デジタル顕微鏡カメラ | ライカ | NA | |
| ニコン A1S 共焦点顕微鏡 | ニコンインスツルメンツ株式会社 | ||
| Nikon NIS AR Version 4.40 | ニコンインスツルメンツ株式会社 | NA | 顕微鏡ソフトウェア |
参考文献
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-te....
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再版と許可
