Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.
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Artículo de método
Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO
En este artículo
Resumen
Resumen
NEMO es una proteína de andamiaje que desempeña un papel esencial en la vía NF-B mediante el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. Tras la activación, el complejo IKK fosforila las moléculas de I-B que conducen a la translocación nuclear NF-B y a la activación de genes diana. La inhibición de la interacción NEMO/IKK es un paradigma terapéutico atractivo para la modulación de la actividad de la vía NF-B, haciendo de NEMO un objetivo para el diseño y el descubrimiento de inhibidores. Para facilitar el proceso de descubrimiento y optimización de los inhibidores NEMO, diseñamos una construcción mejorada del dominio de unión IKK de NEMO que permitiría la determinación de la estructura de la proteína en forma de apo y mientras se unía a inhibidores de peso molecular pequeño. Aquí presentamos la estrategia utilizada para el diseño, expresión y caracterización estructural del dominio de enlace IKK de NEMO. La proteína se expresa en células de E. coli, solubilizadas en condiciones de desnaturalización y purificadas a través de tres pasos cromatográficos. Discutimos los protocolos para la obtención de cristales para la determinación de la estructura y describimos las estrategias de adquisición y análisis de datos. Los protocolos encontrarán una amplia aplicabilidad a la determinación de la estructura de los complejos de NEMO y los inhibidores de moléculas pequeñas.
Introducción
La vía NF-B se activa en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, productos microbianos y estrés, para regular la expresión de genes diana responsables de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, la muerte celular o la supervivencia y proliferación1. Patologías incluyendo enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer2,3,4,5 se han correlacionado con la hiperactivación de la vía, que ha hecho de la modulación de la actividad NF-B un objetivo principal para el desarrollo de nuevas terapias
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Protocolo
1. Diseño de la construcción para cristalografía
- Clonar la secuencia de NEMO-EEAA como en la publicación anterior12 en un vector para la expresión en E. coli utilizando el promotor T7, incluyendo una etiqueta de hexa-histidina N-terminal y un sitio de escisión de proteasa.
NOTA: En este protocolo, utilizamos un vector modificado para incluir una etiqueta N-terminal hexa-histidina y un sitio de escote del Virus etch del Tabaco (TEV)10. Este vector facilita el escote de la etiqueta His para la cristalización de proteínas y deja sólo la extensión corta de los residuos de GSW antes del inicio de la secu....
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Resultados
Clonación, expresión y purificación del dominio iKK vinculante de NEMO.
El protocolo seguido en este estudio para obtener la secuencia final de NEMO-EEAA(Figura 1A),que produjo cristales de calidad de difracción, implicó la expresión y caracterización de todas las construcciones intermedias, incluyendo la adición de los adaptadores de bobina enrollada en N- y C-terminus, las mutaciones C76A, C95S y las mutaciones E56A, E57A. La Figura.......
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Discusión
Los intentos de cristalización de NEMO en forma no enlazada no tuvieron éxito, incluidos los intentos de usar la proteína de longitud completa y varias construcciones de truncamiento que abarcan el dominio de unión IKK. Nuestra caracterización biofísica del dominio iKK-unión de NEMO (residuos 44-111) por dicroísmo circular, espectroscopia de RMN y anisotropía de fluorescencia indicó que la construcción, aunque capaz de unir IKK, existía en un estado de intercambio conformación, no adecuado para la cristalización
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos al Profesor D. Madden, por muchas discusiones útiles a lo largo de este proyecto. Agradecemos al profesor D. Bolon por el regalo del plásmido que contiene la bobina enrollada GCN4 optimizada. Agradecemos al Dr. B. Guo por los plásmidos NEMO. Agradecemos a Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili y Amy E. Kennedy por demostrar el procedimiento. Agradecemos a la Instalación Básica de Cristalografía BioMT y a los departamentos de Química y De Bioquímica y Biología Celular de Dartmouth por el uso del equipo de cristalografía y el personal de BioMT por su apoyo. Esta investigación utilizó la línea de haz AMX de la National Synchrotron Light Source II, una Oficin....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20% p/v γ-PGA (forma Na+, LM) | Dimensiones moleculares | MD2-100-150 | Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA |
| 3,5 kDa MWCO Membrana de diálisis | Spectra/Por | 132724 | Para la diálisis eliminación de imidazol |
| Amicon Stirred Cell Millipose | Sigma | UFSC 05001 | Para la concentración de proteínas |
| Cloruro de amonio | Millipore Sigma | G8270 | Para el marcaje mínimo de medios |
| Benzonase nucleasa | Millipore Sigma | 9025-65-4 | Para la digestión de ácido nucleico |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Células competentes | Agilent Technologies | Modelo: 230245 | Expresión de TEV |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Kit de crioprotectores |
| D-Glucosa (Dextrosa) | Millipore Sigma | A9434 | Para Etiquetado de medios mínimos |
| Difco Caldo Estréfico | ThermoFisher | DF043817 | Para el crecimiento del cultivo |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | Para la reducción de disulfuros |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expresión de NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | sin etiquetar Manipulador de líquidos/constructor de pantallas | |
| HCl & ndash; Solución de 1,0 M | Hampton Research | HR2-581 | Para la cristalización de malla fina de NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare 28989333 | Para la purificación por exclusión de tamaño | |
| HisTrap HP Columna de 5 mL | GE Healthcare | 17524802 | Para la purificación de NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | marcados con His Dimensiones moleculares | MD1-59 | Para el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA |
| HT 96 Dimensiones | moleculares | MD1-46 | Para el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA |
| Imidazol | ThermoFisher | 288-32-4 | Para elución de la columna His-trap |
| Isopropil-beta-D-tiogalactósido | Goldbio | I2481C5 | Para la inducción de cultivos |
| Placa de cristalización MRC2 Hampton | Research | HR3-083 Placa de | cristalización |
| NT8 - Incubadora de gotas | Formulatrix | Cristalización | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | Para la clonación de NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | Para la clonación de NEMO-EEAA |
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo | ThermoFisher | 36978 | Para la inhibición de proteasas |
| Botella de policarbonato para uso en rotor ultracentrífuga tipo 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Botella ultracentrífuga |
| Polietilenglicol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | Para la producción de TEV |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | mutagénesis dirigida al sitio |
| Ensamblaje de tapas requerido: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge Tapa de botella |
| ROCK IMAGER | Formulatrix Cristalización Imager | ||
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 Generación de | semillas |
| Cloruro de sodio ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | Para la amortiguación de soluciones de purificación |
| TCEP (Clorhidrato de fosfina Tris (2-Carboxietilo) | Goldbio | TCEP1 | Agente reductor |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | Para el cribado de matriz dispersa de NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | Para la cristalización de cribado fino de NEMO-EEAA |
| Tris – Solución de 1,0 M | Hampton Research | HR2-589 | Para la cristalización de pantalla fina de NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (polvo Thermofisher | 15504020 | Para la amortiguación de soluciones de purificación | |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | Para la desnaturalización de NEMO-EEAA |
Referencias
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncog....
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Reimpresiones y permisos
