이 프로토콜은 예쁜꼬마선충의장 투과성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 장 내 박테리아와 숙주 간의 상호 작용과 관련된 장 건강에 대한 기본 생물학적 연구와 새는 장 증후군 및 염증성 장 질환을 치료하는 프로바이오틱 및 화학 약제 식별 스크리닝에 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
살아있는 유기체에서 장 과다 투과성은 많은 염증성 장 질환 (IBDs)으로 이어지는 심각한 증상입니다. Caenorhabditis 예쁜꼬마선충은 짧은 수명, 투명성, 비용 효율성 및 동물 윤리 문제의 부족으로 인해 분석 시스템으로 널리 사용되는 비 포유류 동물 모델입니다. 이 연구에서는, 높은 처리량의 심상 분석 시스템을 가진 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성에 다른 박테리아 및 3,3'-diindolylmethane (DIM)의 효력을 조사하기 위하여 개발된 방법. 벌레는 다른 창자 박테리아에 감염되거나 48 시간 동안 DIM으로 공동 처리되었고 플루오레세인 이소티오차네이트 (FITC)-덱스렌을 하룻밤 동안 공급하였다. 이어서, 장 투과성은 웜 체 내부의 형광 이미지와 형광 강도를 비교하여 조사되었다. 이 방법은 또한 동물 모델에서 장 침투성에 영향을 미치는 probiotic 및 병원 성 장 내 박테리아를 식별 하는 잠재력을 가질 수 있습니다 및 장 투과성 및 장 건강에 유해 하거나 건강 증진 화학 물질의 효과 검사에 대 한 효과적. 그러나, 이 프로토콜은 또한 유전 수준에 있는 몇몇 상당한 제한이 있습니다, 특히 이 방법은 주로 현상형 결정에 사용되기 때문에, 질병을 통제하기 위하여 변경되는 유전자를 결정하기위한. 또한,이 방법은 감염 시 염증을 일으키거나 벌레의 침투성을 증가시키는 병원성 기질이 정확히 무엇인지 결정하는 데 국한됩니다. 따라서, 박테리아의 화학 성분 분석 뿐만 아니라 돌연변이 박테리아와 선충을 이용한 분자 유전 적 메커니즘의 조사를 포함하여 추가심도 연구가 필요하며, 장 투과성을 결정하는 박테리아와 화학 물질의 기능을 완전히 평가할 필요가 있다.
서론
장 투과성은 장내 미생물 및 점막 면역과 관련된 주요 장벽 중 하나로 간주되며 장내 미생물 변형, 상피 손상 또는 점액 층 변경과 같은 여러 요인에 의해 영향을 받을 가능성이1. 최근 논문은 장 세포 층2에걸쳐 형광 플럭스 비율을 분석하여 배양 인간 장의 장 투과성을 측정하는 효과적인 프로토콜을보고, 하지만 적은 연구 논문은 선충에서 창자 투과도를 측정하기위한 적절한 절차를 제시, 특히 C. elegans에서,FITC-dextran 염색을 사용하여.
나일 레드3 및 에리오글라우신 디소듐(또는 스머프 분석)을 사용하여 C. 예쁜꼬마선충의 장 투과성을 측정하기 위한 두 가지 대표적인 프로토콜이있다 4,5. 이 프로토콜에서는 나일 레드(MW = 318.37) 및 에리오글라우신 디소듐(MW = 792.85)보다 훨씬 높은 분자량을 가지는 FITC-dextran(평균 분자량 10,000)을 사용했습니다. FITC-dextran은 나일 강색 또는 에리오글라우신 디소듐 염료보다 장층을 통해 흡....
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프로토콜
1. P. aeruginosa PAO1 및 대장균 OP50 배양준비
- 멸균된 루리아-베르타니(LB)배지(표 1)의500 mL를 준비하고 P. aeruginosa의 단일 콜로니를 배지에 접종하였다. 37°C에서 14~15시간 동안 배양하고 150 rpm의 흔들림 속도로 배양한다.
- 세균 배양을 2개의 500 mL 원심분리기 튜브에 균등하게 분배하고 30분 동안 4°C에서 3,220 x g에서 튜브를 원심분리합니다.
- 부피가 50 mL (초기 부피의 1/10)가 될 때까지 상류를 제거하고 세균 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 농축된 세균 배양액을 사용 전까지 4°C에서 보관한다. P. aeruginosa 문화의 저장 기간은 최대 1 개월까지 될 수 있습니다., 하지만 신선한 문화 장 손상을 유도 에 대 한 더 나은.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 전체 살아있는 박테리아 이외에, 세균 배양의 상상체는 장내세균(19)의효과를 시험하는데 사용될 수 있다. - 대장균 OP50을 준비하기 위해, 배양....
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결과
P. aeruginosa PAO1을 가진 배양 후에, C. 예쁜꼬마선충은 다른 2개의 세균성 긴장으로 배양 후에 도시된 형광에 비해 웜 바디에 있는 FITC-dextran 형광에 있는 유의한 증가를 보여주었습니다(그림 1). 대장균 OP50, P. aeruginosa PAO1 및 E. faecalis KCTC3206을 공급한 벌레의 형광 강도는 각각 100.0±6. 369.7±38.9, 및 105.6±10.6%였다. 데이터는 P. aeruginosa가 상피 창자 장벽에 더 중요한 손상을 일으켰다는 것을 강조하고, 그러므로, 벌레는 그들의 장 투과성에 있는 극적인 증가를 전시했습니다. 이 결과에 기초하여, FITC-dextran은 장층을 통해 쉽게 침투할 수 있으므로 P. aeruginosa는 DIM의 효과를 스크리닝하기 위한 잠재적인 후보 병원체로 선택되었다.
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토론
자동 형광 현미경 및 정량적 이미지 분석을 결합한 C. elegans의 창자 투과성을 결정하는 이 새로운 방법을 활용하여 장내 미생물 이나 화학 물질에 의한 차이를 생체 내에서, 특히 C. elegans 장에서 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 투과성 조사에 유용하며 편리하고 쉬운 조작으로 인해 스트레스 조건 및 형태 학적 검사에서 반응성 산소 종 (ROS) 측정과 같은 많은 작업에 적용 할 수 있습니다. 더욱이,이 방법은 C. elegans의 여러 병원체에 대한 치료 및 예방 방법의 효과를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 유해하고 유용한 박테리아를 모두 포함하는 상이한 세균 균주의 기전을 조사하는 효율적인 프로토콜일 수 있다. 일부 병원체와 유사한 구조를 가진 프로바이오틱 박테리아는 숙주33,34에다른 효과를 발휘한다. 이 절차는 박테리아가 이용하고 있는 어떤 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
본 연구는 한국과학기술원 내연구보조금(2E29563)의 지원을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3,3'-디인돌릴메탄 | 시그마 | D9568 | |
| 90× 15mm 페트리 접시 | SPL 생명 과학, 한국 | 10090 | |
| 60× 15mm 페트리 접시 | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| 포름알데히드 용액 | 시그마 | F1635 | |
| 뇌 심장 주입(BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| 콜레스테롤 | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 well black with clear flat bottom Non-treated, no lid 폴리스티렌 | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony 소프트웨어 | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB 미디엄 | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| 플루오로마운트 수성 마운팅 매체 | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS 고함량 분석 시스템 | PerkinElmer | ||
| 펩톤 | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| 녹농균 PA01 | 유형 배양을 위한 한국 컬렉션 | KCTC NO. 1637 | |
| 염화나트륨 | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| 실체 현미경 | Nikon, 일본 | SMZ800N | |
| 효모 추출물 | Becton Dickinson | REF. 212750 |
참고문헌
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J.
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재인쇄 및 허가
