Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Summary

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Abstract

Las bacterias intracelulares secretan factores de virulencia llamados proteínas efectoras en el citosol huésped que actúan para subvertir las proteínas huésped y/o sus vías biológicas asociadas en beneficio de la bacteria. La identificación de proteínas efectoras bacterianas putativas se ha vuelto más manejable debido a los avances en la secuenciación del genoma bacteriano y la llegada de algoritmos que permiten en silico la identificación de genes que codifican candidatos a la secreción y/o eucariotas Dominios. Sin embargo, la identificación de estos importantes factores de virulencia es sólo un paso inicial. Naturalmente, el objetivo es determinar la función molecular de las proteínas efectoras y dilucidar cómo interactúan con el huésped. En los últimos años, técnicas como la pantalla dos híbridas de levadura y las inmunoprecipitaciones a gran escala, junto con la espectrometría de masas, han ayudado a identificar interacciones proteína-proteína. Aunque la identificación de un socio de unión huésped es el primer paso crucial para dilucidar la función molecular de una proteína efector bacteriana, a veces se encuentra que la proteína huésped tiene múltiples funciones biológicas (por ejemplo, actina, clathrin, tubulina), o la proteína bacteriana puede no unir físicamente las proteínas huésped, privando al investigador de información crucial sobre la vía exacta del huésped que se está manipulando. Se ha adaptado una pantalla de toxicidad por levadura modificada junto con una pantalla supresora para identificar las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras bacterianas. La pantalla de toxicidad se basa en un efecto tóxico en la levadura causado por la proteína efectora que interfiere con las vías biológicas del huésped, que a menudo se manifiesta como un defecto de crecimiento. La expresión de una biblioteca genómica de levadura se utiliza para identificar factores de huésped que suprimen la toxicidad de la proteína efectora bacteriana y así identificar proteínas en la vía a la que se dirige la proteína efector. Este protocolo contiene instrucciones detalladas tanto para las pantallas de toxicidad como para las pantallas supresoras. Estas técnicas se pueden realizar en cualquier laboratorio capaz de clonación molecular y cultivo de levadura y Escherichia coli.

Introduction

El primer informe de procedimientos similares a los aquí presentados caracterizó al efector de la Legionella pneumophila tipo IV SidD, una deAMPylase que modifica Rab1¹. Se utilizaron técnicas comparables para la caracterización de varios efectores L. pneumophila ^1,2,3. El ensayo fue adaptado para caracterizar una proteína efectora Coxiella burnetii tipo IV^4,y recientemente la utilidad de esta técnica se amplió para la caracterización de las proteínas de membrana de inclusión de Chlamydia trachomat....

Protocol

1. Preparación de medios y reactivos

NOTA: Las planchas deben prepararse antes del día del ensayo y son buenas durante 1 mes. Los medios y reactivos se pueden hacer en cualquier momento y son buenos durante 1 mes.

1. Preparar 1 L de la solución de glucosa (10% p/v) disolviendo 100 g de D-(+)-glucosa en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Ajuste el volumen a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de almacenamiento de medios de 1 L.
2. Preparar 1 L de la solución de galactosa (10% p/v) disolviendo 100 g de galactosa D-(+) en 800 ml de agua destil....

Results

Antes de que se pueda realizar la pantalla supresora de levadura real, la proteína efector de interés debe ser probada para la toxicidad en la levadura. Esto se logra expresando la proteína de interés en la levadura bajo el control de un promotor inducible de galactosa. El crecimiento de la glucosa (condiciones no inductivas) debe compararse primero para garantizar que la toxicidad se deba específicamente a la expresión de la proteína de interés y no sea un defecto general. Como se muestra en la Figu.......

Discussion

Este protocolo describe los procedimientos paso a paso para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas utilizando una pantalla de toxicidad y supresor de levadura modificada. La cepa de levadura utilizada, S. cerevisiae W303, es auxotravófica tanto para uracilo como para leucina. La auxotrofia Uracil de la cepa se utiliza para seleccionar levaduras portadoras de la proteína de interés en el vector pYesNTA-Kan, mientras que la auxotrofia de leucina se utiliza par.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific BP2641500
Millipore de GalactosaSigma	G0750-1KG
extracción de gel GeneJet	ThermoFisher Scientific	K0691
Kit de purificación de PCR GeneFisher	Scientific	K0701
Kit de minipreparación de plásmidos GeneJet	Thermo	K0503
Glucosa	MilliporeSigma	G8270-1KG
ADN de esperma de arenque	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Acetato de litio dihidratado	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptona	Fisher Scientific
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530
Poli(etilenglicol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202S
Triptófano	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S Extracto de
levadura	Fisher Scientific	BP1422-500
Kit de minipreparación de levadura	Zymo	D2001
Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos	MilliporeSigma	Y0626-250G
Suplementos de Medio Drop-out Sintético de Levadura	MilliporeSigma	Y1501-20G	sin uracilo
Suplementos de Medio Drop-out Sintético de Levadura	MilliporeSigma	Y1771-20G	sin uracilo, leucina, triptófano