المقدمة هنا هو بروتوكول للكشف عن الإنتاج الضام (MET) فخ خارج الخلية في ثقافة الخلايا الحية باستخدام المجهر وتلطيخ فلوري. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لدراسة محدده علامات البروتين التقي بتلطيخ المناعي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم تحديد الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية (ETs) من العدلات باعتبارها عاملا مساهما في تطوير الامراض المتعلقة بالتهاب مزمن. العدلات ETs (الناموسيات) تتكون من شبكه من الحمض النووي ، والبروتينات هيستون ، والبروتينات الحبيبية المختلفة (اي ، الميلوكسيداز ، اللدائن ، و كاتيبسين G). الخلايا المناعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة ، ويمكن أيضا ان تنتج ETs ؛ ومع ذلك ، إلى اي مدي يحدث هذا في الجسم الآخر وما إذا كانت الفخاخ خارج الخلية الضامة (ميتس) تلعب دورا في أليات المرضية لم يتم فحصها بالتفصيل. لفهم أفضل دور ميتس في الامراض التهابيه ، تم تطوير بروتوكول لتصور الإفراج عن التقي من الضامة البشرية الاوليه في المختبر ، والتي يمكن أيضا ان تستغل في التجارب المناعية. وهذا يسمح بمزيد من توصيف هذه الهياكل ومقارنتها مع ETs الصادرة من العدلات. الضامة البشرية المشتقة من الخلايا (HMDM) تنتج ميتس عند التعرض لمحفزات التهابيه مختلفه بعد التمايز إلى النمط الظاهري M1 الموالية للالتهابات. ويمكن تصور الإفراج عن ميتس عن طريق المجهر باستخدام الأخضر الفلورسنت وصمه عار الحمض النووي التي يتم تعريضها للخطر الخلايا الحية (علي سبيل المثال ، SYTOX الخضراء). استخدام الضامة الابتدائية المعزولة الطازجة ، مثل HMDM ، هو مفيد في النمذجة في الظواهر التهابيه الجسم التي هي ذات الصلة للتطبيقات السريرية المحتملة. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة الإفراج عن الخلايا البشرية الاحاديه الخلية (علي سبيل المثال ، thp-1) بعد التمايز في الضامة مع خلات ميريستات phorbol أو غيرها من خطوط الخلايا الضامة (علي سبيل المثال ، الضامة murine-مثل الخلايا J774A).
المقدمة
تم تحديد الإفراج عن ETs من العدلات لأول مره كاستجابة مناعية فطريه الناجمة عن العدوى البكتيرية1. وهي تتكون من العمود الفقري الحمض النووي التي ترتبط البروتينات الحبيبية المختلفة مع خصائص مضاده للبكتيريا ، بما في ذلك اللدائن العدلات و myeloperoxidase2. الدور الرئيسي لل العدلات (الناموسيات) هو للقبض علي مسببات الامراض وتسهيل القضاء عليها3. ومع ذلك ، بالاضافه إلى دور وقائي من ETs في الدفاع المناعي ، وقد اكتشف عدد متزايد من الدراسات أيضا دورا في الامراض المرضية ، وخاصه خلال تطوير امراض يحركها التهاب (اي التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين4). ويمكن تشغيل الإفراج عن ETs من قبل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم عزل HMDM من المستحضرات البشرية معطف بافي المقدمة من بنك الدم مع موافقه الأخلاق من منطقه سيدني الصحية المحلية.
1. الثقافة HMDM
- عزل الخلايا الاحاديه من الاستعدادات معطف بافي أعدت من الدم المحيطي من المتبرعين البشرية الصحية باستخدام استعداد تجاريا المتاحة لعزل الخلايا الليمفاوية ، تليها التيار الطرد المركزي المضادة لل19، 20-الآن
- تاكيد وجود الخلايا الاحاديه عن طريق الخلايا الخلوية وتلطيخ مع تعديل Giemsa وصمه عار لتوصيف الخلايا الاحاديه19.
- تحت ظروف معقمه ، وضبط كثافة الخلايا الاحاديه إلى 1 × 106 خليه/مل باستخدام rpmi-16....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تظهر صور برارفيلد التي تظهر التغيرات المورفولوجية لل HMDM استجابه لمحفزات لتمايز الخلايا في الشكل 1. وأظهرت الضامة M1 الاستقطاب من التجارب مع HMDM يتعرض لifnγ و LPS شكل خليه ممدود والمغزل ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (اللوحة الوسطي). النسبة للمقارنة ، فان شكل الضامة M2 الاستقطاب بعد التعرض لل HMDM إلى IL-4 ل 48 h كانت عاده مستديرة ومسطحه ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (لوحه اليمين المتطرف).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجيل والتصور من تشكيل اجتمع باستخدام M1 المتمايزة HMDMs يمثل نموذج جديد في المختبر التي قد تكون مفيده للتحقيق في الدور المرضي المحتملة لهذه الهياكل الضامة ، وخاصه تحت التهابات مزمنة الظروف. ويوفر بروتوكولا قويا لتحفيز الضامة البشرية الاوليه للإفراج عن ميتس ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم في الدراسات ذات الصلة مع البويضات البشرية أو خطوط الخلايا الضامة murine. ان التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول لتحفيز تكوين الاجتماعات من قبل HMDM يعتمد علي ثقافة الخلايا الدقيقة والتعامل معها للحفاظ علي سلامه الخلايا الجيدة. وهذا سيزيد من مدي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه الأثر الدائم (IPAP201601422) ومنحه المشروع الطبي الحيوي لمؤسسه نوفو نورديسك (NNF17OC0028990). كما يعترف باستلام الجائزة الاستراليه للدراسات العليا من جامعه سيدني. ونود ان نشكر السيد بات بيسساراكسيت والسيدة مورغان جونز علي المساعدة في العزلة الاحاديه وثقافة الانسجه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 120Q مصدر ضوء الفلورسنت واسع الطيف | EXFO Photonic Solutions ، تورنتو ، كندا | سلسلة x-cite | |
| Corning CellBIND لوحة الآبار المتعددة (12 بئرا) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | لزراعة الخلايا |
| مجموعة صبغة Quik التفاضلية (Giemsa المعدلة) | Polysciences Inc. | 24606 | توصيف الخلايا الوحيدة |
| الملح المتوازن هانكس (HBSS) 14025050 | ثيرمو فيشر | لخطوات الغسيل ومعالجة HOCl | |
| حمض هيبوكلوروس (HOCl) | سيجما ألدريتش | 320331 | لتحفيز MET |
| PMC4031 إنترفيرون جاما | ثيرمو فيشر | لتحضير M1 | |
| إنترلوكين 4 | العلوم المتكاملة | rhil-4 | لتحضير M2 |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | لتحفيز MET |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | تمت إضافته إلى وسائط |
| الثقافة عديدات السكاريد | الدهنية المتكاملة | العلوم tlrl-eblps | لتحضير M1 |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | لعزل الخلايا الوحيدة |
| أوليمبوس IX71 مقلوب مجهر | أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان | ||
| فوربول 12- ميريستات 13-أسيتات (PMA) | سيجما ألدريتش | P8139 | لتحفيز MET |
| محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) | سيجما ألدريتش | D5652 | لخطوات الغسيل |
| وسائل الإعلام | سيجما ألدريتش | R8758 | لزراعة الخلايا |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | ل MET visulaization |
| TH4-200 مصدر ضوء المجال الساطع | أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان | سلسلة x-cite | |
| عامل نخر الورم ألفا | لونزا | 300-01A-50 | لتحفيز MET |
المراجع
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
