Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума

5.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60554

⸱

12 апреля 2020 г.

 , 
1Davee Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine Chicago, 2Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University Feinberg School of Medicine Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Демонстрируется здесь является эффективным и экономически эффективным методом для очистки, культуры и дифференцировать белые стволовые клетки материи от послеродового мозжечка мыши.

Аннотация

Большинство мозжечковых нейронов возникают из двух эмбриональных стволовых ниш: ромбические губы нишу, которая генерирует все мозжечковые возбуждающие глутамамергические нейроны, и желудочковой ниши зоны, которая генерирует ингибирующие GABAergic Purkinje клеток, которые являются нейронами, которые составляют глубокие ядра мочеиссожиек и Бергман. Недавно была описана третья ниша стволовых клеток, которая возникает как второстепенная зародышевая зона из ниши желудочковой зоны. Клетки этой ниши определяются маркером поверхности клеток проминин-1 и локализованы в развивающемся белом веществе послеродового мозжечка. Эта ниша приходится конце родился молекулярный слой ГАМК-интернейронов наряду с послеродовой генерируемых мозжечковых астроцитов. В дополнение к их роли в развитии, эта ниша приобретает переводное значение в отношении его участия в нейродегенерации и опухолевого генезиза. Биологию этих клеток было трудно расшифровать из-за отсутствия эффективных методов их очистки. Здесь демонстрируются эффективные методы очищения, культуры и дифференцирования этих послеродовых стволовых клеток мозжечка.

Введение

Мозжечок уже давно признан в качестве основного нейрональной цепи координации добровольного движения1. Он получает входные данные из широких полос нейрооаксиса, который включает в себя проприоцептивную информацию с периферии, с тем чтобы точно настроить выход двигателя и координировать движение. В последнее время он также был вовлечен в регулирование познания и эмоции, потенциально используя аналогичные сети обработки информации2,3,4.

Взрослый мозжечок состоит из внешней мозжечковой коры и внутреннего белого вещества. Перемежаются в этих структурах глубоко интрейреблярных ядер. Как и в остальной части нервной системы, развитие мозжечка обусловлено распространением многопотентных клеток-прародителей (стволовых клеток), которые мигрируют и дифференцируются, чтобы дать эту хорошо организованную структуру. В начале развития (E10.5-E13.5), желудочковой стволовой ниши вокруг развивающихся четвертого желудочка генерирует ГАМК нейронов (т.е., Purkinje клеток, Лугаро клетки, клетки Golgi) вместе с Бергманн глия5,6,7,8.

Позже в развитии (послеродовая неделя один), вторая ниша стволовых клеток в ромбической губы генерирует MATH1- и Nestin-выражения прародителей, которые приводят к возбуждающим гранул нейронов9,10,11,12. Недавно третья ниша стволовых клеток была описана13. Эти клетки выражают проминин-1 (также известный как CD133), мембранно-охватывающий гликопротеин, который определяет подмножество стволовых клеток в кишечнике и гематопогетических системах14,15,16. Картирование судьбы vivo показывает, что эти стволовые клетки генерируют ключевые молекулярные интернейроны (т.е. клетки корзины и стеллатные клетки), наряду с астроцитами, в течение первых трех послеродовых недель. В прошлом, было трудно изучить эти клетки в пробирке, потому что предыдущие методы требуют дорогостоящих и трудоемких методов (т.е. флуоресценция активированных клеток сортировки »FACS» которые зависят от prominin-1 окрашивание12,13,17. Этот протокол описывает иммуномагнитный метод изоляции этих стволовых клеток, которые затем могут быть легко культивированы и дифференцированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных (2011) и были одобрены Макuc Северо-Западного университета (Protocol IS00011368).

1. Подготовка решений

  1. Подготовка раствора диссоциации тканей из стерильного фенола, красносодержащего фосфатно-буферизированный солевой раствор Dulbecco (DPBS) с папаном (100 U/ml), цистеином (0,2 мг/мл) и DNase (250 U/ml).
  2. Для приготовления раствора DNase разбавить 100 мг лиофилизированного порошка DNase I (одна бутылка) в 50 мл H2O. Хорошо перемешайте и профильтруйте бульонный раствор. Приготовьте 10 мл запасов aliquots. Разделите одну трубу на 0,5 мл одноразового использования aliquots. Храните эти одноразовые aliquots при -80 градусах По Цельсию.
  3. Подготовка магнитных реагентов разделения путем подготовки магнитной колонки буфера X: 0,5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) и 2 мМ EDTA решение.
  4. Для подготовки нейросферных носителей используйте нейробазальную среду, содержащую пенициллин/стрептомицин с L-глютамином и дополнить 2% B27, 20 нг/мл человека рекомбинантным эпидермальным фактором роста (EGF), и 20 нг/мл человеческого рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (bFGF).
  5. Для подготовки дифференциации средств массовой информации, использовать нейробазальной среды и дополнения с 10 нг / мл дифференцированного фактора тромбоцитов полученных (PDGF-AA) или 10 нг / мЛ ингибирующего фактора лейкемии (LIF) и 2% B27.
  6. Используйте ультра-низкие крепления 12 хорошо (3,5 см2)и 6 хорошо (9,6 см2) культурные пластины.

2. Рассеивание Церебеллума

  1. Обезболилизировать щенков мыши (P3-P7) с изофлураном и обезглавить с помощью хирургических ножниц.
  2. Спрей отделенной головы щенков с 70% этанола.
  3. Перенесите каждую голову в пустую стерильную культурную тарелку 10 см. Разделите кожу с помощью ножниц микродиссекции, а затем удалить череп, запустив ножницы sagittal вдоль средней линии.
  4. Используя #7 щипцы, снимите кости черепа, начиная caudally от ствола мозга. Аккуратно поднимите мозг с помощью шпателя, сохраняя мозжечок нетронутым, и перенесите мозг на свежую стерильную тарелку 10,0 см, содержащую 15 мл раствора сбалансированной соли (HBSS) ледяного холода Хэнкса.
  5. Поместите блюдо, содержащее мозг под микроскопом вскрытия. Используя мелкие #5 щипцы, удалить одра и крупные кровеносные сосуды из мозжечка и отделить мозжечок от ствола мозга с помощью шпателя.
  6. Перенесите мозжечок в центрифугу мощностью 15 мл, содержащую 5,0 мл ледяного раствора HBSS. Вымойте мозжечок путем полоскания и декантации 3x с 5,0 мл HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый мозжечок должен быть помещен в свою собственную трубку для дальнейшей обработки.

3. Подготовка подвески клеток

  1. После последнего промыть, добавить 5 мл папаин основе ткани диссоциации решение (на основе предыдущей работы13,18), который был предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию. Инкубировать ткань в течение 15 мин при 37 градусах По Цельсию на водяной бане. Медленно смешивайте содержимое, инвертируя трубку вверх и вниз 3x-5x каждые 3 мин либо с помощью nutating смеситель или вручную.
  2. Подготовка широкого диаметра (обычный стеклянный пипетка) и узкий диаметр Пастер пипетка (огонь полируется путем нагрева над горелкой Bunsen), как описано ранее19.
  3. Вымойте ткань 3x с 5 мл раствора HBSS, избегая потери ткани при декантации вручную.
  4. Удалите последнюю промывку HBSS и добавьте 5 мл раствора DPBS, содержащего 250 зликат раствора DNase в ткани. Разъедините ткань путем triturating 10x-15x используя широкий диаметр pipette Pasteur. Выполните этот шаг осторожно, чтобы избежать образования пузырьков.
  5. Затем инкубировать суспензию в течение дополнительных 10 минут при 37 градусах по Цельсию в водяной бане, смешивая путем инвертирования и выпрямляя трубку.
  6. Используйте уменьшенный диаметр пастера pipette для дальнейшего triturate ткани шлам 10x. Если большие куски ткани остаются, прижмите части ткани к нижней части трубки с кончиком пипетки осторожно и продолжать пипетки, пока клетки не достигнут тонкой подвески.
  7. Инкубировать ткань при 37 градусах Цельсия в течение дополнительных 10 минут, повторяя предыдущие шаги смешивания.

4. Иммуномаркировка стволовых клеток

  1. Поместите центрифуги труб на льду и использовать ледяные растворы для следующих шагов. Процедить разъединенные клетки через 40 мкм ячейки ситечко в 50 мл центрифуги трубки. Топ фильтр с 10,0 мл раствора HBSS, чтобы убедиться, что клетки проходят через сетку в этом дополнительном решении.
  2. Перенесите отфильтрованные клетки в свежую центрифугу мощностью 15 мл и центрифугите суспензию клетки при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Аспирируйте и отбрасывайте супернатант полностью, тщательно используя вакуумный аспиратор.
  3. Приостановите гранулы в 160 л буфера магнитной колонки. Чтобы получить одноклеточную подвеску до магнитной маркировки, проходят клетки через 30 мкм нейлоновой сетки, чтобы удалить ячейки сгустки, которые в противном случае могут засорить столбец.
  4. Добавьте 40 qL антипроминина-1 микробусов к каждой трубке 15 мл, перемешайте и инкубируйте в холодильнике в течение 15 минут, чтобы антитела связывались с проминином-1-выражения клетками.
  5. Вымойте клетки, добавив 1,0-2,0 мл столбцового буфера X и центрифуги на 300 х г в течение 10 минут.
  6. Отрежь гранулу в 1,0 мл буфера столбца X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если небольшие комки видны после повторного перевеса гранул с 1,0 мл столбцового буфера X, они должны быть удалены осторожно с помощью кончика пипетки Пастера, в противном случае эти комки могут блокировать магнитную колонку во время сортировки клеток.

5. Подготовка магнитной колонки, сортировка и покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитное отделение от различных условий генотипа (болезнь против контроля) должно быть выполнено в то же время, так как любая задержка может повлиять на морфологию нейросферы.

  1. Подготовьте магнитные колонны, поместив их на магнитную стойку, подвергшуюся воздействию магнитного поля. Промыть столбец один раз с 500 зл буфера X, применяя буфер, который капает в центрифужную трубку, чтобы быть отброшены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер магнитной колонки X для каждого эксперимента; если нет, то выход стволовых клеток будет низким.
  2. Нанесите на столбец сметную суспензию. Соберите проход, содержащий немаркированные клетки, которые в основном состоят из мозжечковых нейрональных / глиальных смешанных клеток в свежие трубы 15 мл(рисунок 1A).
  3. Вымойте столбец 3x с 500 qL буфера X (каждая стирка занимает около 2-4 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Церебеллярная нейрональная/глиальная смешанная культура, обогащенная мозжечковыми гранулированными нейронами, может служить полезным побочным продуктом этого шага очистки.
  4. Снимите столбец с магнитного поля и поместите в трубку 1,5 мл. Добавьте 1,0 мл культуры среды (нейросфера среды) в колонку и нажмите поршень в колонку, чтобы промыть из клеток помечены промин-1 бисером в свежий 1,5 мл сокол трубки.
  5. Для повышения чистоты промин-1 помеченных клеток, пройти eluted клеток по второй колонке следующие шаги 5.1-5.4.
  6. Подсчитайте клетки гемоситометром. Типичная урожайность составляет 107 клеток на мозжечок. Плита клетки на ультра-низких пластин крепления (6 или 12 хорошо, на основе плотности, необходимой для экспериментов вниз по течению).

6. Прохождение нейросфер и дифференциация

  1. Плита prominin-1-маркированных стволовых клеток на ультра-низкой привязанности 12 хорошо пластин в нейросфере среды (5000 клеток / хорошо).
  2. После 7-10 дней, клетки делятся, чтобы дать мяч формы плавающих нейросфер (первичных нейросфер).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, вторичные нейросферы, которые расширяются в цифрах генерируются для дальнейшего использования. Первичные популяции нейросферы не используются для этих экспериментов, так как они могут содержать загрязняющие клетки, которые не имеют свойств стволовых клеток и могут слипаться с нейросферами.
  3. Для прохождения, передача первичных нейросфер вместе с культурой средств массовой информации с помощью 1,0 мл пипетки советы 15 мл стерильной центрифуги трубки. Пелле нейросферы центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин и отбрасывайте супернатант.
  4. Приостановите гранулы в 5 мл тканевых диссоциационных носителей, которые содержат папаин или 0,05% трипсин раствор. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  5. Центрифуги яточной подвески на 300 х г в течение 5 мин. Resuspend клетки в 5 мл нейросферной среды и разъединить клетки механически с помощью пластиковой пипетки Пастер и медленно пипетки вверх и вниз 10x.
  6. Плита клетки (опять же) в нейросфере средств массовой информации, как описано ранее. После 7-10 дней в культуре, пластина должна быть обогащена вторичными нейросферами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры могут быть пройден до 8x с хорошей эффективностью, после чего размер нейросферы, как правило, меньше и наводящий на снижение пролиферации.
  7. Подсчитайте клетки на гемоцитометре и наметите оптимальное число для будущих экспериментов на поли-D-лизиновых пластинах (6 или 12 скважин).
  8. Чтобы дифференцировать стволовые клетки, собирать нейросферы от второго до восьмого прохода центрифугией, как описано ранее, за исключением добавления среды дифференциации к гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 7 дней in vitro, стволовые клетки дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты, о чем свидетельствует окрашивание с нейрональным маркером Тбулина, астроцитарным маркером GFAP и производителем олигодендроцитов O4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Проминин-1-положительные послеродовые стволовые клетки формируются нейросферы в нейросфере среды, богатой факторами роста (EGF и bFGF). Эти нейросферы были положительными для prominin-1-окрашивания, маркер, используемый для изоляции, а также в качестве пятна для других маркеров стволовых клеток, таких как Nestin и GFAP13 (Рисунок 1). Выражение маркера стволовых клеток поддерживалось по всей культуре и по крайней мере до восьми отрывков20. При с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Проминин-1-выражения мозжечковые стволовые клетки находятся в перспективных белого вещества в течение первых 3 недель послеродовой жизни. Их пролиферация жестко контролируется звуковым пути ежа поддерживается Purkinje клетки17. Эти стволовые клетки / прародители способствуют более поздним РОЖДЕННЫм ГАМК-интернейронов, называемых клетками корзины и клетками стеллата. Эти interneurons находятся в молекулярном слое, где они синапс на клетки Purkinje и лепить топографии ПК и функции через ГАМК ингибир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируются.

Благодарности

Мы благодарим членов лаборатории Opal за их предложения. Эта работа была поддержана грантами NIH 1RO1 NS062051 и 1RO1NS08251 (Opal P)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05%ТрипсинThermo Fisher Scientific253000540,05%
2% B27Gibco; Thermo Fisher Scientific17504001
2 мМ раствор ЭДТАCorning46-034-CI
Анти-Проминин-1 микрогранулыMiltenyi Biote130-092-333
Бычий сывороточный альбуминSigmaA9418
Колонна MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Культуральные планшеты ультра - низкое прикреплениеCorning3473
ЦистеинСигмаС7880
ДНКазаСигмаД4513-1ВЛ250 Ед/мл
Дульбекко s Фосфатный буфер физиологического раствораThermo Fisher Scientific14040141
Hank's сбалансированный раствор соли-HBSSGibco14025-092
Человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластовPromegaG507A20 нг/мл
Человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор ростаPromegaG502A20 нг/мл
Фактор ингибирования лейкемииSigmaL5158
L-глутаминGibco25030081
микроскопLieca TCS SP5 конфокальный микроскоп
MiniMACS сепараторMiltenyi Biotec130-042-102
Мышиный анти-проминин-1Affymetrix eBioscience14-13311 в 100
NestinAbcamab279521 в 200
Нейробазальная средаThermo Fisher25030081
O4MilloporeMAB345
PapainWorthingtonLS003126(100 Ед/мл)
Тромбоцитарный фактор ростаSigmaH829110 нг/мл
поли-D-лизинSigmaP6407
Кролик анти-тубулин, b-IIISigmaT22001 из 500
Rabit anti-GFAPDakoZ03341 из 500
Разделительные колонки-MS колонкиMiltenyi Biotec130-042-201
Стерильное клеточное ситечкоFisher Scientific2236354740 μ м

Ссылки

  1. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  2. Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
  3. Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
  4. Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
  5. Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
  6. Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337(2014).
  7. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450(2014).
  8. Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition. Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).
  9. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
  10. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  11. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  12. Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
  13. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
  14. Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
  15. Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
  16. Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
  17. Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
  18. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
  19. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
  20. Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
  21. Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
  22. Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
  23. Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
  24. Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
  25. Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
  26. Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207(2019).
  27. Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
  28. Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
  29. Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Стволовые клетки мозжечкамагнитная сепарация клетокдиссоциация тканейфильтрация через клеточный фильтрпротокол центрифугированияформирование нейросфердифференцировка стволовых клетокпостнатальный мозжечокметод культивирования клеток
Очистка Проминина-1- Стволовые клетки от постнатального мышиного церебеллума
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.