Qui, presentiamo un protocollo per misurare rapidamente e facilmente il fattore nucleare kappa-luce-catena-potenziatore delle cellule B attivate (NF-B) attivazione in linee cellulari che esprimono NF-B::luciferate reporter costruisce, attraverso misurazioni di luminescenza nel lisato di cella. Inoltre, l'espressione genica viene determinata tramite RT-qPCR isolata da cellule infettate da Salmonella Typhimurium.
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Articolo metodologico
Attivazione e quantificazione dell'espressione genica infette da NF-B nelle cellule di coltura dei tessuti infetti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fattore di trascrizione dimerico NF-B regola molte vie di risposta cellulare, comprese le vie infiammatorie inducendo l'espressione di varie citochine e chemiochine. La NF-B è espressa in modo conforme ed è sequestrata nel citosol dal fattore nucleare della proteina inibitoria del potenziatore del gene del polipeptide a luce kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa (IB). L'attivazione di NF-B richiede la degradazione di I'B, che espone poi un segnale di localizzazione nucleare su NF-B e promuove il suo traffico al nucleo. Una volta nel nucleo, NF-B si lega alla regione promotore dei geni bersaglio NF-B come l'interleumina 6 (IL-6) e l'IL-23, per promuoverne l'espressione.
L'attivazione di NF-B si verifica indipendentemente dalla trascrizione o dalla traduzione. Pertanto, lo stato di attivazione di NF-B deve essere misurato quantificando nF-B in modo specifico nel nucleo, sia quantificando l'espressione dei geni bersaglio NF-B. In questo protocollo, le cellule trattate stabilmente con un costrutto reporter NF-B::luciferate vengono analisi per l'attivazione di NF-B utilizzando tecniche di coltura dei tessuti in vitro. Queste cellule sono infettate da Salmonella Typhimurium per attivare NF-B, che traffica verso il nucleo e si lega a siti bB nella regione promotrice di luciferasi, inducendone l'espressione. Le cellule vengono lisci e analizzate con il sistema di analisi luciferasi. La quantità di luciferasi prodotta dalle cellule è correlata all'intensità del segnale di luminescenza, che viene rilevato da un lettore di piastre. Il segnale di luminescenza generato da questa procedura fornisce un metodo rapido e altamente sensibile mediante il quale valutare l'attivazione di NF-B in una serie di condizioni. Questo protocollo utilizza anche la trascrizione inversa quantitativa PCR (RT-qPCR) per rilevare i livelli relativi di mRNA che sono indicativi dell'espressione genica.
Introduzione
La famiglia di proteine a fattore nucleare B (NF-B) sono importanti attivatori di trascrizione che regolano l'espressione genica in vari percorsi biologici. L'attivazione di NF-B induce la trascrizione dei geni bersaglio, molti dei quali sono importanti per le risposte immunitarie e infiammatorie, la proliferazione cellulare, le risposte allo stress e la progressione del cancro1,2. La NF-B svolge un ruolo fondamentale nella mediazione degli esiti infiammatori precoci per la bonicccanazione degli agenti patogeni. Considerati i numerosi processi biologici mediati dall'attivazione di NF-B, le interruzioni nella s....
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Protocollo
1. Passaggio cellulare e seeding
- Mantenere le cellule HeLa 57A in un flacone da 75 cm2 contenente 10 mL del supporto Aquila (DMEM) modificato di Dulbecco, integrato con il 5% di calore inattivato dal siero bovino fetale (FBS) a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 del 5%.
- Supporti di coltura cellulare aspirati e lavare con 1 mL di 0.05% soluzione trypsin-EDTA. Pioppo e sostituire con un ulteriore 1 mL. Collocare il pallone in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per 4-5 min per consentire alle cellule di staccarsi dal flacone.
- Aggiungere 9 mL di coltura cellulare e lavare delicatamente il fondo del pallone un....
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Risultati
L'analisi qui descritta si concentra sull'attivazione del fattore di trascrizione NF-B utilizzando un giornalista lucidferasi dipendente da NF che viene scambialmente trasvenuto in una linea di cellule HeLa. Attivato NF-B trasloca nel nucleo dove lega i siti di legame B dei geni bersaglio, comprese le citochine pro-infiammatorie IL6 e IL23. Una panoramica generale dell'attivazione di NF-B è illustrata nella figura 1. Il batterio gram-negativ.......
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Discussione
Il principale contributo del protocollo descritto è che fornisce un metodo semplice e veloce per rilevare l'attivazione di NF-B nelle cellule, che consente un'analisi ad alta produttività di più condizioni di stimolazione o farmaci che influiscono sull'attivazione di NF-B. In questo caso, descriviamo un protocollo per l'attivazione di NF-B nelle cellule HeLa infettate da Salmonella. Queste cellule possono essere utilizzate per l'infezione da altri patogeni, nonché per studiare l'impatto dell'infezione batterica .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca nel laboratorio Keestra-Gounder è supportata dalle sovvenzioni del NIAID del NIH sotto il premio Number R21AI122092 e dall'American Diabetes Association sotto il premio numero 1-18-JDF-035.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pellicola adesiva | VWR International | 60941-070 | |
| Cloroformio | Fisher Bioreagenti | C298-500 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11665092 | |
| Kit per il trattamento del DNAse | Qiagen | 79254 | |
| dNTP | Promega | U1511 | |
| Etanolo | Fisher Bioreagenti | BP2818100 | cellule |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A | Ref # 15 | ||
| Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità | Biosistemi applicati | 4368814 | |
| Isopropanolo | Fisher Bioreagenti | BP26181 | |
| Kanamicina | Fisher Bioreagenti | BP906-5 | |
| LB agar | Fisher Bioreagenti | BP1425-500 | |
| Brodo di lisogenesi | Fisher Bioreagenti | BP1426-500 | |
| MgCl2 | Fisher Chemical | ||
| Spettrofotometro | NanoDrop ND-1000 | Thermo Scientific | |
| Sistema di analisi della luciferasi Promega | Promega | E1501 | Tampone di lisi cellulare e substrato |
| di luciferinaRandom Hexamers | Thermo Scientific | SO142 | |
| diretto GAPDH in tempo reale | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Primer | ||
| inverso GAPDH in tempo reale | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Primer | ||
| diretto IL-23 in tempo reale | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCCCC TGAT-3'In | ||
| tempo reale IL-23 reverse primer | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Real-time | ||
| IL-6 forward primer | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'Realtime | ||
| IL-6 reverse primer | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'Reverse | ||
| Transcriptase | Applied Biosystems | 4308228 | |
| RNAsi inibitore | Thermo Scientific | EO0381 | |
| RT tampone | Promega | A3561 | |
| SL1344 | Ref # 17 | ||
| SL1344 Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039 | Ref # 18 | ||
| SL1344 Δ sopE e Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039 | Ref # 18 | ||
| SYBR verde | Applied Biosystems | 4309155 | 2x mastermix |
| Tri-reagente | Centro di ricerca molecolare | TR 118 | tiocianato di guanidina |
| Tripsina -EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | 0,05% di tripsina-EDTA |
| Acqua ultrapura | Fisher Bioreagenti | ||
| pozzetti per PCR | VWR International | 89218-294 | Piastra a 384 pozzetti |
Riferimenti
- Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. NF-kappaB signaling in inflammation. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).
- Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival. Antioxidants & Redox Signaling. 8....
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Ristampe e permessi
