تهدف هذه المقالة إلى توفير منهجية لتحول العدوى إلى اللافروسية في أجنة الفئران باستخدام حقن متعددة لتعليق الفيروس في الفضاء perivitelline الزيغوت. يتم استخدام الفئران الإناث التي تزاوج مع سلالة الذكور الخصبة مع لون فرو المهيمنة مختلفة لتوليد الأمهات بالتبني الحوامل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام نهج ناقلات لينديفيس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا هي مهمة بشكل أساسي للبحوث الطبية الحيوية الحديثة. إن دمج الجينات الأجنبية في أجنة الفئران أو الفئران المبكرة هو أداة لا تقدر بثمن لتحليل وظائف الجينات في الكائنات الحية. تعتمد طريقة تحويل التكوين القياسية على حقن أجزاء الحمض النووي الأجنبية في نواة من البويضات المخصبة. وتستخدم هذه التقنية على نطاق واسع في الفئران ولكنها لا تزال غير فعالة نسبيا وتتطلب من الناحية التقنية في الأنواع الحيوانية الأخرى. ويمكن أيضا إدخال الترانسجين في الأجنة ذات مرحلة الخلية الواحدة عن طريق العدوى بفيروس اللارض، مما يوفر بديلا فعالا للحقن برونووي القياسية، وخاصة في الأنواع أو السلالات ذات بنية الأجنة الأكثر تحديا. في هذا النهج، يتم حقن التعليق الذي يحتوي على ناقلات الفيروس في الفضاء perivitelline من جنين الفئران المخصبة، والتي هي من الناحية الفنية أقل تطلبا ولديه معدل نجاح أعلى. وقد تبين أن ناقلات الفيروس الليندية تدمج الجين المتحول بكفاءة في الجينوم لتحديد توليد خطوط معدلة مستقرة. وعلى الرغم من بعض القيود (مثل متطلبات المستوى 2 للسلامة البيولوجية، وحدود حجم شظايا الحمض النووي)، فإن تحويل الجينوجينيس إلى اللادفيروسات هو طريقة سريعة وفعالة لتولد الجين. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم استخدام الفئران الإناث التي تزاوج مع سلالة الذكور الخصبة مع لون فرو المهيمنة مختلفة كبديل لتوليد الأمهات بالتبني الحوامل.
المقدمة
لسنوات عديدة، تم استخدام القوارض المختبرية، مثل الفئران والجرذان، لنمذجة الحالات الفسيولوجية والمرضية البشرية. وقد أدت البحوث الحيوانية إلى اكتشافات لم تكن قابلة للتحقيق بأي وسيلة أخرى. في البداية ، ركزت الدراسات الجينية على تحليل الاضطرابات والظواهر التي تحدث تلقائيًا التي تعتبر تحاكي عن كثب الحالة البشرية1. وسمح تطوير أساليب الهندسة الوراثية بإدخال أو حذف جينات محددة للحصول على النمط الظاهري المطلوب. لذلك ، يتم التعرف على جيل الحيوانات المعدلة وراثيا كتقنية أساسية في البحوث الحديثة التي تسمح بإجراء دراسات لوظيفة الجينات في الكائنات الحية.
أصبحت تكنولوجيا الحيوانات المحورة وراثيا ممكنة من خلال مزيج من الإنجازات في ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكان إنتاج ناقلات العدوى الفيروسية وتطبيقها وفقاً للمبادئ التوجيهية للسلامة البيولوجية من المستوى 2 ووافقت عليها وزارة البيئة البولندية. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية المحلية على جميع الإجراءات التجريبية للحيوانات التي يرد وصفها أدناه. تم إيواء الحيوانات في أقفاص مهواة بشكل فردي في درجة حرارة مستقرة (21-23 درجة مئوية) والرطوبة (50-60٪) مع الإعلان libitum الوصول إلى الماء والغذاء تحت 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة مظلمة.
1- إنتاج ناقلات الفيروس اللين
- التقُرال ة للخلايا HEK 293T
ملاحظة: تم تصميم البروتوكول الذي يتم تقديمه هنا لالتقاشي من عشرين أطباق ثقافة Ø10 سم التي تنتج ما يقرب من 200 مل من ناقلات الخام supernatant.- الخلايا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام البروتوكول الموصوف هنا، تم إنتاج ناقلات العدوى المُرضية التي حملت بناء Syn-TDP-43-eGFP (titer LV الفعلي = 3.4 × 108/μL) ومن ثم يمكن استخدامها للحقن تحت زوزال الجنين في مرحلة واحدة. فقط أجنّة مع اثنان بوونينوينيّ مرئية كان أخضعت إلى الإجراء. تم تحديد عدد حقن التعليق الفيروسي تجريبيًا. واعتبرت كفاءة الزرع العالية والافتقار المتزامن للنسل المعدل وراثيا مؤشرات على عدم كفاية عدد الجسيمات الفيروسية من أجل نقل ناجح. في هذه الحالة، تم زيادة عدد الحقن. وأسفرت الإدارة الوحيدة لـ LV عن ولادة 20 فأراً من جيل F0، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد جعل التقدم في التكنولوجيات المعدلة وراثيا نماذج القوارض أداة لا تقدر بثمن في البحوث الطبية الحيوية. أنها توفر الفرصة لدراسة العلاقات النمط الجيني والنمط الظاهري في الجسم الحي. هنا، نقدم بديلاً متاحاً على نطاق واسع للتوليد التقليدي عن طريق الحقن النووي. استخدام نقل الجينات lentiviral يتجاوز الحاجة إلى الحقن المجهري ة المطالبة لأن ناقلات الفيروسية يمكن حقنها تحت pellucida زونا. هذا النهج لا يؤثر على سلامة الجنين، والذي يضمن أساسا معدل البقاء على قيد الحياة 100٪ للالزيجوت اتحقن. يتم دمج الترانسجين الذي يتم دمجه عن طريق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لصاحب البراءة (W.K.) حقوق في براءة الاختراع، "طريقة إنتاج الحيوان المعدل وراثيا"، من مكتب براءات الاختراع في جمهورية بولندا (رقم P 355353؛ 21.03.2008).
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع ANIMOD ضمن برنامج Team Tech Corefacilits Plus التابع لمؤسسة العلوم البولندية ، الذي شارك في تمويله الاتحاد الأوروبي في إطار صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي إلى WK.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 7500 نظام PCR في الوقت الحقيقي | الأنظمة الحيوية | ||
| التطبيقية Aerrane (isoflurane) | Baxter | FDG9623 | |
| للماصات الشعرية الدقيقة المعايرة | Sigma | A5177-5EA | |
| Atipam 5 مجم / مل | Eurovet Animal Health BV | N / A | 0.5 مجم / كجم |
| Baytril 25 مجم / مل (إنروفلوكساسين) | باير | N / A | 5-10 مجم / كجم |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط GC100TF-15 | هارفارد اجهزة ليمتد | 30-0039 | حقن شعرية |
| بوبيفاكائين 25 مجم / مل | Advanz Pharma | N / A | 0.25٪ in 0.9٪ كلوريد الصوديوم |
| بوتوميدور 10 مجم / مل (بوتورفانول طرطرات) | أوريون فارما | N / A | 1 مجم / كجم |
| طبق زراعة خلايا الأنسجة سيلستار 35 ملم | Greiner Bio-One | 627160 | |
| طبق ثقافة خلايا الأنسجة CELLSTAR 60 مم | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CellTram Oil | Eppendorf | 5176 000.025 | |
| Cepetor (Medetomidine) 1 مجم / مل | cp-pharma | N / A | 0.5 مجم / كجم |
| Chorulon ، الغدد التناسلية المشيمية البشرية ؛ | إنترفيت | غير | 150 وحدة دولية / مل 0.9٪ كلوريد الصوديوم |
| DMEM منخفض الجلوكوز | سيجما ألدريتش | D6048 | |
| DNase ، خال من RNase | A& التكنولوجيا الحيوية | 1009-100 | |
| EmbryoMax الزيوت المعدنية الخفيفة المصفاة | Sigma | ES-005-C | |
| مغلف بروتين الترميز البلازميد لنواقل الفيروسات (VSVg البلازميد) | ADDGENE | 14888 | |
| FemtoJet | Eppendorf | 4i / 5252 000.013 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma Aldrich | F9665-500ML | |
| فوليجون ، فرس حامل s مصل موجهة الغدد التناسلية | Intervet | N / A | 125 وحدة دولية / مل في خلايا .9٪ كلوريد الصوديوم |
| HEK 293T ؛ | ATCC | ATCC CRL-3216 | |
| Hyaluronidase من Bovine Testis | سيجما | H4272-30 ملغ | 0.5 ملغ / مل في |
| مجهر مقلوب متوسط M2 ؛ | زايس | أكسيفيرت 200 | |
| كيتامين 100 مجم / مل | Biowet Pulawy | N / A | 50 مجم / كجم |
| بارافين سائل | Merck Millipore | 8042-47-5 | |
| M16 متوسط EmbryoMax | Sigma | MR-016-D | |
| M2 متوسط | سيجما | M7167 | |
| كلوريد المغنيسيوم 1M | سيجما ألدريتش | 63069-100 مل | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| زيت معدني | Sigma | M8410-500ML | |
| كلوريد الصوديوم 0.9٪ | POLPHARMA OTC | N / A | معقم ، 5 مل أمبولات |
| مجهر التشغيل ؛ | Inami Ophthalmic Instruments | Deca-21 | |
| نظام التعبئة والتغليف ترميز البلازميد لناقلات الفيروسات العدسية (دلتا R8.2 بلازميد) | كاشف ADDGENE | 12263 | |
| PEI (بولي إيثيلينيمين ، ميغاواط ~ 25،000 ،) ، | Polysciences، Inc | 23966-1 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ML | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلايا | Sigma Aldrich | 806552-500ML | |
| Puller ؛ | شركة سوتر للأدوات | P-97 | |
| مشبك انعكاس تطبيق / مقاطع انعكاسية | أدوات الدقة | العالمية 500345 / 500346 | |
| سافيل ، حمض البولي جليكوليك ، مضفر ، مطلي ، خيوط قابلة للامتصاص | B.Braun 1048029 | ||
| الجراحي مجهر | أوليمبوس | SZX16 | |
| خيط الخياطة الجراحية | B.Braun & nbsp ؛ | C1048040 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | نظام حيوي تطبيقي | 4334973 | |
| تولفيدين 4٪ (حمض تولفيناميك) | فيتوكينول | N / A | 2 مجم / كجم |
| TransferMan NK2 | Eppendorf | N / A | |
| محلول التربسين EDTA | Sigma Aldrich | T3924-500ML | |
| جهاز طرد مركزي فائق | Beckman Coulter | Optima L-100 XP & nbsp ؛ | |
| VacuTip | Eppendorf | 5175108.000 | حاملي الشعيرات الدموية |
| Vita-POS | Ursapharm | N / A | مرهم العين |
| لوحة تسخين | Semic | N / A | |
| صانع الساعات ملقط | VWR | 470018-868 |
المراجع
- Lazar, J., Moreno, C., Jacob, H. J., Kwitek, A. E. Impact of genomics on research in the rat. Genome Research. 15 (12), 1717-1728 (2005).
- Tarkowski, A. K. Studies on mouse chimeras developed from eggs fused in vitro. National Cancer Institute Monographs. 11, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
