인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

요약

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 시험관 내 분화는 생물학적 및 분자 수준 모두에서 인간의 발달을 연구하는 능력을 변형시키고 재생 응용 프로그램에 사용하기 위해 세포를 제공했습니다. 콜로니 형 배양을 이용한 hESC 배양에 대한 표준 접근법은 미분화 hESCs 및 배아 체(EB) 및 상이한 세균 층으로의 분화를 위한 로제트 형성을 유지하기 위해 비효율적이고 시간이 많이 소요된다. 여기서 제시된 것은 콜로니형 배양 대신 hESC를 이용한 단일 세포 배양 방법이다. 이 방법을 사용하면 콜로니 형 hESCs에 필적하는 수준에서 hESC 마커의 발현을 포함하여 미분화 hESCs의 특성 특징을 유지 보수 할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 1주일 이내에 NPC를 생산하는 단일 세포 형 hCS로부터 신경 전구 세포(NPC) 생성을 위한 효율적인 방법을 제시한다. 이 세포는 몇몇 NPC 마커 유전자를 높게 표현하고 도파민성 신경세포 및 성상세포를 포함하여 각종 신경 세포 모형으로 분화할 수 있습니다. hESCs를 위한 이 단세포 배양 시스템은 이 프로세스의 분자 기계장치, 특정 질병의 연구 및 약 발견 스크린을 조사하는 데 유용할 것입니다.

서론

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 3 개의 1 차적인 세균 층으로 분화하는 잠재력을 가지고, 그 때 각종 다능성 전구 세포 계보로 분화합니다. 이 혈통은 이후에 인체에 있는 모든 세포 모형을 초래합니다. 시험관 내 hESC 배양 시스템은 인간 배아 발달을 연구하는 능력을 변화시켰으며 이러한 과정이 생물학적 및 분자 수준에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 통찰력을 얻기위한 귀중한 도구로 사용되었습니다. 유사하게, 인간 환자에서 분리된 체세포 를 재프로그래밍해서 생성된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 연구 결과는 각종 질병에 새로운 통찰력을 제공합니다. 또한, hESCs로부터 유래된 전구 및 분화 세포는 줄기세포 치료 및 약물^{스크리닝1,2,3,4와}관련된 연구에 유용할 수 있다.

hESCs는 광범위한 자기 갱신 능력을 가진 다중 전위 세포인 신경 전구 세포 (NPC)로 분화하도록 유도될 수 있습니다. 이어서, 이들 세포는 뉴런, 성상세포 및 올리고엔드로시트^5,

프로토콜

1. hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트 준비

1. hESC 자격을 갖춘 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조)를 적어도 2-3시간 동안 4°C에서 천천히 해동하여 겔형성을 피합니다.
2. 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하려면 차가운 DMEM/F12에서 매트릭스를 2% 최종 농도로 희석하십시오. 잘 혼합하고 희석 매트릭스 용액의 1 mL와 6 웰 플레이트의 각 우물을 코팅합니다.
3. 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 플레이트를 실온(RT)에서 적어도 3시간 또는 4°C에서 밤새 배양한다.
   참고: 지하 멤브레인 매트릭스가 있는 플레이트는 매트릭스 용액을 제거하고 플레이트를 사용하기 전에 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 단세포 hESC 배양에 콜로니 형 hESCs의 적응

1. 지하 막 매트릭스에서 자란 식민지형 H9(WA09) hESCs의 피더 프리 배양액을 통과하기 위해, 웰로부터 배지를 흡인(도1A)^9.
2. DPBS 1mL로 1x를 씻으소서. 웰당 1 mL의 디....

결과

여기에 제시된 것은 hESCs의 단일 세포 형 배양및 신경 전구 세포로의 효율적인 분화의 유지 및 확장을 위한 개선된 프로토콜이며, 이는 이어서 다양한 다운스트림 신경 계보로 분화되고, 도파민성 뉴런과 성상 세포를 포함.

대표적인 상 대비 이미지는 단일 세포 형 배양에 대한 콜로니 형 hESCs의 적응 동안 상이한 단계에서 세포 형태를보여준다(도 1A). 단세포 배양 조건을 통해, 적응된 hESCs가 고밀도로 유지될 수 있었고, 그 후 합류에 도달할 때 쉽고 효율적으로 배양할 수 있었다는 것을 알 수있었다(도 1A, B). 이들 세포는 콜로니 형 hESCs의 전형적인 세포 주기 특성(즉, 짧은 G1 상 및 S상에서 세포의 높은 비율)을 유지하였다(도1

토론

다양한 계보로 hESCs를 분화하고 충분한 수의 분화 세포를 생성하기 위한 확장 가능하고 효율적인 방법은 약물 스크리닝 및 줄기 세포 치료에 중요한 기준입니다. 다양한 단세포 통과 방법이 발표되었으며, 이 때 세포는 생존을 향상시키기 위해 ROCK 억제제 또는 다른 소분자의 존재에서 배양되지만, 이들 배양 방법의 최종 제품은 콜로니 형 hESCs^{17,18,19,20, 21이다.} 이전에 발표된 방법^{19,20,21,22에}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm m-접시	ibidi	81156	세포 배양 접시
6웰 플레이트	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	세포 분리 솔루션
Activin A	R& D 시스템	338-AC-050
아스코르브산	시그마 알드리치	A4403
B27 보충제	Thermo Fisher	17504044
B27 보충제 (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	응용 생물학적 재료	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
원심분리기	DAMON/ICE	428-6759
CO2 인큐베이터	Thermo Fisher	4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel)	Corning	354277	Basement membrane matrix (여기 대부분의 프로토콜에 사용됨)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	세포 동결 용액
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
소 태아 혈청	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	응용 생물학적 재료	Z101705
GDNF	응용 생물학적 재료	Z101057
Geltrex 매트릭스	Thermo Fisher	A1569601	기저막 매트릭스
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	글루타민 보충제, 100X
H9 (WA09) 인간 배아 줄기 세포주	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
녹아웃 DMEM	Thermo Fisher	10829018
녹아웃 세럼 교체용	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC 배양 배지
N2 보충제	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-Ornithine	Sigma Aldrich	P3655
ROCK 억제제	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	응용 생물학적 재료	Z200617
Stemdiff 신경 전구 매체	Stemcell Technologies	5833	NPC 확장 배지