هنا نقدم طريقه الفرز لبيروفوسفاتاسي الغشائية (من Thermotoga maritima) مثبطات استنادا إلى رد فعل الموليبدينوم الأزرق في شكل لوحه بشكل جيد 96.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الاغشيه البركانية المرتبطة بالغشاء (mPPases) هي انزيمات ديميريكه تحدث في البكتيريا والنباتات والطفيليات. هذه البروتينات يلتصق بيروفوسفات في اثنين من جزيئات مقوم العظام, الذي يقترن مع البروتون و/أو أيون الصوديوم ضخ عبر الغشاء. منذ لا تحدث البروتينات المتماثلة في الكائنات والبشر ، mPPases هي المرشحين جيده في تصميم أهداف المخدرات المحتملة. هنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص مثبطات mPPase باستخدام تفاعل الأزرق الموليبدينوم في 96 نظام لوحه جيدا. نحن نستخدم mPPase من بكتيريا thermophilic Thermotoga ماريتيما (tmppase) كانزيم نموذج. هذا البروتوكول بسيطه وغير مكلفه ، وتنتج نتيجة متسقة وقويه. يستغرق الأمر حوالي ساعة واحده فقط لإكمال بروتوكول فحص النشاط من بداية الفحص حتى قياس الامتصاص. وبما ان اللون الأزرق المنتج في هذا الفحص مستقر لفتره طويلة من الزمن ، يمكن اجراء المقايسة اللاحقة مباشره بعد الدفعة السابقة ، ويمكن قياس الامتصاص في وقت لاحق لجميع الدفعات دفعه واحده. العيب في هذا البروتوكول هو ان يتم ذلك يدويا ، التالي يمكن ان تكون مرهقه ، فضلا عن تتطلب مهارات جيده من التنضيد وحفظ الوقت. وعلاوة علي ذلك ، فان محلول ارسينيت سيترات المستخدم في هذا الفحص يحتوي علي ارسينيت الصوديوم ، وهو سام وينبغي التعامل معه بالاحتياطات اللازمة.
المقدمة
ما يقرب من 25 ٪ من مجموع البروتينات الخلوية هي البروتينات غشاء وحوالي 60 ٪ منهم المخدرات الأهداف1،2. واحده من الأهداف المخدرات المحتملة3, الغشاء المتجهة بيروفوسفواسات (mppases), هي الانزيمات الديميريكه التي ضخ البروتون و/أو أيون الصوديوم عبر الغشاء عن طريق التحلل من بيروفوسفات في اثنين من تقويم العظام4. ويمكن العثور علي mPPases في الكائنات الحية المختلفة5 مثل البكتيريا ، والنباتات ، والطفيليات التقدمية ، باستثناء البشر والحيوانية4. في الطفيليات التقدمية ، علي سبيل المثال منجلي البلازما ، الغدد التناسلية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اعداد البروتين
ملاحظه: تم وصف التعبير وتنقيه TmPPase في مكان آخر13.
- اعداد 10 مل من حل أعاده التنشيط العازلة التي تحتوي علي 20 مم 2-(ن-مورتولينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) pH 6.5 ، 3.5 ٪ (v/v) الجلسرين ، 2 مم ديثيوثريتول (dtt) ، و 0.05 ٪ دوديسيل مالتوسيدي (DDM).
- اعداد 10 مل من خليط التفاعل التي تحتوي علي 200 مم تريس-Cl الأس الهيدروجيني 8.0 ، 8.0 mM MgCl2، 333 Mm kcl ، و 67 Mm nacl.
ملاحظه: Mg2 + مطلوب لمخلب بيروفوسفات كما الركيزة من Mppase ،K + مطلوب لزيادة نشاط الانزيم كما Tmppase هو mppase تعتمد البوتاسيوم ، وهناك حاجه إلىNa + لنشاط الانزيم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفي هذا البروتوكول ، تم اختبار ثماني مركبات (1 − 8) (الشكل 2 ا) مع المشردين داخليا ، وهو مثبط شائع للفوسفازات البركانية ، كعنصر تحكم إيجابي. تم اختبار كل مجمع في ثلاثه تركيزات مختلفه (1 μM ، 5 μM و 20 μM) في ثلاثي النسخ. ويصور سير العمل في الفحص في الشكل 1، بدءا من اعداد العينة والكاشف حتى قياس الامتصاص عند 860 نانومتر.
في نهاية هذا البروتوكول ، بعد أضافه الحل ا + ب و ارسينيت سترات ، والحلول تطوير اللون الأزرق مستقره مع الحد الأقصى لل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل لفحص بسيط من مثبطات لبيروفوسفاتاسي الغشاء المرتبطة من t. maritima في شكل لوحه جيدا 96 استنادا إلى Vidilaseris وآخرون14. هذا البروتوكول غير مكلفه واستنادا إلى حمض 12 فوسفوميوليبديك ، الذي يتكون من الفوسفات والموليبدات في ظل الظروف الحمضية وخفضت إلى فوسفوموليبدينوم الأنواع مع لون ازرق مميز12. ويفضل هذا الأسلوب علي البروتوكولات الأخرى ، مثل الفحص الأخضر مالاكيت أكثر حساسية16، لان هذا الأسلوب لا تظهر التدخل في وج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من مؤسسه جين واياتوس ايركو و BBSRC (BB/M021610) إلى أدريان غولدمان ، اكاديميه فنلندا (رقم 308105) إلى كيني فيدياسريس ، (رقم 310297) إلى هنري اكسارد ، و (رقم 265481) إلى جاري لي-كاوهالوما ، واليي جامعه هلسنكي للبحوث المالية إلى غوستاف بويجي اف جينناس (). ويشكر المؤلفون برناديت جهل علي مساعدتها الفنية خلال المشروع.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ورقة الختم اللاصقة | Thermo Scientific | AB0558 | |
| الأمونيوم سباعي الموليبدات رباعي الهيدرات | Merck | F1412481 636 | |
| حمض الأسكوربيك | سيجما ألدريتش | 95212-250G | |
| BioLite 96Well متعدد | الأطباق الحرارية العلمية | 130188 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | Merck 1167431000 | ||
| أنبوب PCR 8 آبار 0.2 مل بدون أغطية (120) | الوراثة نيبون | FG-028 | |
| دوديسيل مالتوسيد (DDM) | ميلفورد | B2010-100G | |
| الإيثانول | ميرك | 1009901001 | |
| حمض الخليك الجليدي | ميرك | 1000631011 | |
| حمض الهيدروكلوريك | سيجما ألدريتش | 258148-500 مل | |
| إيميدودي فوسفات الصوديوم ملح | سيجما ألدريتش | I0631-1G | |
| L- & ألفا - فوسفاتيديل الكولين من فول الصويا الليسيثين | سيجما | 429415-100 جم | |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش | 8147330500 | |
| ألواح PCR متعددة الألواح 96 جيدا | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan الصعود (النوع 750) | المختبرات | ||
| طبق بتري البوليسترين (مقاس 150 مم × 15 مم) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| كلوريد البوتاسيوم | Merck 104936 | ||
| Prism 6 برنامج | GraphPad | ||
| QBT2 كتلة التسخين | أدوات منحة | ||
| الصوديوم ميتا زرنيخيت | فيشر كيماويكال | 12897692 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| بيروفوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | Fluka | 71501-100G | |
| سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدرات | Fluka | 71404-1KG |
المراجع
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
