تم تطوير نظام نموذج في المختبر لالتقاط التغيرات المعمارية الأنسجة أثناء سرطان الرئة الحرشفية (LUSC) التقدم في ثقافة 3-الأبعاد (3D) المشتركة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). يوفر هذا النظام العضوي منصة فريدة من نوعها للتحقيق في أدوار التغيرات المتنوعة الجوهرية للخلايا السرطانية والخارجية التي تعدل النمط الظاهري للورم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نظام ثقافة الرئة المتعددة الأبعاد لنموذج سرطان الرئة الحرشفية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب تفاعلات الورم وستروما دورًا حاسمًا في تطور سرطان الرئة الحرشفي (LUSC). ومع ذلك ، فإن فهم كيفية مساهمة هذه التفاعلات الديناميكية في التغيرات المعمارية للأنسجة التي لوحظت أثناء تكوين الورم لا يزال صعبًا بسبب عدم وجود نماذج مناسبة. في هذا البروتوكول، نصف إنشاء نموذج ثقافة مشاركة ثلاثية الأبعاد باستخدام ثقافة الخلية الأساسية LUSC المعروفة باسم TUM622. تم إنشاء خلايا TUM622 من xenograft المشتقة من المريض LUSC (PDX) ولها خاصية فريدة من نوعها لتشكيل هياكل تشبه acinar عندما بذرت في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. نحن نثبت أن TUM622 acini في الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخص السمات الرئيسية لهندسة الأنسجة أثناء تقدم LUSC بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين خلايا LUSC ومكونات البيئة الدقيقة للورم (TME) ، بما في ذلك خارج الخلية مصفوفة (ECM) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). كما نقوم بتكييف بروتوكول نا الرئيسي 3D زراعة بيان كيف يمكن استخدام هذا النظام لمختلف التحليلات المصب. وعموما، يخلق هذا النموذج الأورغياني منصة غنية بيولوجيا وقابلة للتكيف تمكن المرء من الحصول على نظرة ثاقبة في الآليات الجوهرية للخلايا والخارجية التي تعزز تعطيل العمارات الظهارية أثناء تطور السرطان وسيساعد البحث عن أهداف علاجية جديدة وعلامات تشخيصية.
المقدمة
سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. سرطان الخلايا الحرشفية الرئة (LUSC) ، وهو ثاني أكثر أنواع سرطان الرئة غير الخلايا الصغيرة (NSCLC) ويمثل حوالي 30٪ من جميع سرطان الرئة ، غالبًا ما يتم تشخيصه في مراحل متقدمة ولديه تشخيص ضعيف1. خيارات العلاج للمرضى LUSC هي حاجة رئيسية غير ملباة التي يمكن تحسينها من خلال فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة التي تدفع LUSC الورم.
كما هو الحال مع معظم أنواع السرطان البشرية ، يتميز الإمراض في LUSC بتعطيل بنية الأنسجة الظهارية السليمة والمنظم بشكل جيد2. خلال هذه العملية ، يتم فقدان قطبية الخلايا القاعدية apical المناسب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. Passaging وزراعة TUM622 الخلايا وCAFs في الثقافات 2D
- التصاريح وزراعة الخلايا TUM622
- الكواشف الدافئة متوسطة الثقافة والخلايا (انظر جدول المواد)لخلايا TUM622 عند 37 درجة مئوية.
- مرور TUM622 الخلايا في 80٪ التقاء في القوارير 2D. عادة، يحدث هذا بعد أسبوع واحد من المرور.
- تجاهل المتوسطة القديمة من قارورة T75 وغسل مرة واحدة مع 6 مل من المخزن المؤقت HEPES. تجنب الأنابيب مباشرة على الخلايا.
- اسشق المخزن المؤقت HEPES. إضافة 4 مل من التربسين / EDTA (0.25 ملغ / مل ، انظر جدول المواد)لشطف سريع وتجاهل التربسين / EDTA.
- إضافة 2 مل من التربسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
TUM622 وCAFs في الثقافة 2D
يعرض الشكل 1 الشكل النموذجي لخلايا TUM622 وCAFs في الثقافة 2D. يتم تقريب خلايا TUM622 مع نواة كبيرة في حين CAFs مسطحة وممدودة. يمكن أن تصل خلايا TUM622 إلى 80٪ -90٪ التقاء في الثقافة. ويؤدي المزيد من الانتشار إلى المزيد من الخلايا الصغيرة المجمعة في مستعمرات لا تلامس هاوية مباشرة. وعلى النقيض من ذلك، تفضل الخلايا المرتفعة الكثافة أن تنمو بكثافة أعلى من الخلايا وستستمر في التكاثر عند التقاء كامل إذا تم توفير ما يك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأورام هي أنسجة غير متجانسة تتكون من الخلايا السرطانية تتعايش جنبا إلى جنب مع الخلايا المترالية مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا الفيوذيلية والخلايا المناعية داخل ECM. معا، هذه المكونات المتنوعة عبر الحديث والتأثير على البيئة الدقيقة الورم، ولعب دور نشط في دفع الورم، وهي العملية التي تنطوي على تغييرات تدريجية في الهندسة المعمارية الورم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون نموذج المختبر لتطوير الورم قادرًا على التقاط التغيرات المعمارية الديناميكية للأنسجة التي لوحظت في الأورام البشرية في الجسم الحي ، والتفاعل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وصاحبا البلاغ هما موظفون ومساهمون في شركة فايزر
شكر وتقدير
نشكر ماغالي غوفروي، وجون كريغر، وستيفاني بيسولكو من مجموعة علم الأمراض الأنسجة في شركة فايزر-الأورام ومجموعة العلامات البيولوجية لدعم علم الأمراض/الأنسجة ومايكل أرينزمان للمراجعة النقدية للمخطوطة. كما نشكر برنامج ما بعد الدكتوراه من Pfizer ومجموعة البحث والتطوير في مجال الأورام، وعلى وجه التحديد روبرت أبراهام، وبوجا سابرا، وكارين ويدبين، وجنيفر تيجيدا على دعمهم للبرنامج.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نمو ظهارة الشعب الهوائية متوسط | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| مصفاة خلية 40um | ThermoFisher | 352340 | لتمرير خلايا TUM622 |
| Cparkd Caspase 3 | تقنية إشارات الخلايا | المضادة 9661 (RRID: AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | لثقافة ثلاثية الأبعاد |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | للثقافة ثلاثية الأبعاد |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (مفضل للثقافة المشتركة) | Bio-Techne | 3443-005-01 | للثقافة ثلاثية الأبعاد |
| الجسم المضاد CXCR4 | Abcam | Ab124824 (RRID: AB_10975635) | الأرانب |
| E-cadherin الأجسام المضادة | BD Biosciences | 610182 (RRID: AB_397581) | الماوس |
| GelCount | Oxford Optronix | لأعداد وقياسات Acini | |
| الأجسام المضادة GM130 | BD Biosciences | 610822 (RRID: AB_398141) | |
| مختبرات ناقلات | مصل الماعز | S1000 (RRID: AB_2336615) | للتألق المناعي |
| FBS | Gibco | 10082-147 | لجل عينة الأنسجة CAFs |
| ريتشارد آلان Scientific | HG-4000-012 | للتألق المناعي | |
| Integrin alpha 6 | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID: AB_2128317) الجسم | |
| المضاد للجرذ Involucrin | Abcam Ab68 | (RRID: AB_305656) | الفأر |
| Ki67 الجسم المضاد | Abcam Ab15580 | (RRID: AB_443209) Rabbit | |
| Lab-Tec II chambered # 1.5 نظام الغطاء الألماني | Nalge Nunc International | 155379 (2) | لثقافة 3D |
| Lab-Tec II غرفة # 1.5 نظام الغطاء الألماني | Nalge Nunc International | 155409 (8) | للثقافة ثلاثية الأبعاد |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | ل CAFs |
| Matrigel (مفضل للثقافة الأحادية) | Corning 356231 | لثقافة 3D | |
| p63 تقنية إشارات الخلية للجسم المضاد | 13109 (SRRID: AB_2637091) | ||
| قلم أرنب / Strep | Gibco | 15140-122 | لكواشف CAFs |
| كواشف الزراعة الفرعية Lonza | CC-5034 | لتفكك الخلايا TUM622 | |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | لتقنية |
| إشارات خلية | الأجسام المضادة | Sox2 3579 (RRID: AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | لتفكك CAF |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | التلقائي عداد الخلايا | |
| Vimentin الجسم المضاد | Abcam | Ab92547 (RRID: AB_10562134) Rabbit | |
| & beta & catenin | تقنية إشارات الخلايا | 2677s (RRID: AB_1030943) | الماوس |
المراجع
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Ma....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
