Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.
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Methodenartikel
Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zebrafish ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens aufgrund seiner transparenten Natur und der Abhängigkeit ausschließlich von seinem angeborenen Immunsystem während der frühen Entwicklung. Das Infektionsmodell des Zebrafischs Mycobacterium marinum (M. marinum) hat sich bei der Untersuchung der Immunantwort des Wirts gegen mykobakterielle Infektionen etabliert. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Makrophagenzell-Todestypen zu den verschiedenen Ergebnissen einer mykobakteriellen Infektion führen werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Intravital-Mikroskopie, um den Tod von Makrophagenzellen in Zebrafisch-Embryonen nach einer M. marinum-Infektion zu beobachten. Zebrafisch transgene Linien, die speziell Makrophagen und Neutrophile kennzeichnen, werden durch intramuskuläre Mikroinjektion von fluoreszierend M. marinum entweder im Mittelhirn oder im Rumpf infiziert. Infizierte Zebrafisch-Embryonen werden anschließend auf niedrigschmelzender Agarose montiert und durch konfokale Mikroskopie in X-Y-Z-T-Dimensionen beobachtet. Da langzeitige Live-Bildgebung niedrige Laserleistung erfordert, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden, wird eine stark exsemitende transgene empfohlen. Dieses Protokoll erleichtert die Visualisierung der dynamischen Prozesse in vivo, einschließlich Immunzellmigration, Interaktion mit Wirtspathogenen und Zelltod.
Einleitung
Eine mykobakterielle Infektion hat gezeigt, dass sie zum Tod von Immunzellenführt 1. Beispielsweise löst ein abgeschwächter Stamm Apoptose in Makrophagen aus und enthält die Infektion. Jedoch, ein virulenter Stamm wird lytische Zelltod auslösen, was bakterielle Verbreitung1,2. In Anbetracht der Auswirkungen dieser verschiedenen Arten von Zelltod auf die antimykobakterielle Reaktion des Wirts ist eine detaillierte Beobachtung des Todesfälles von Makrophagenzellen während einer mykobakteriellen Infektion in vivo erforderlich.
Die herkömmlichen Methoden zur Mess....
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Protokoll
Zebrafische wurden unter Standardbedingungen in Übereinstimmung mit Labortierrichtlinien zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes (GB/T 35823-2018) aufgezogen. Alle Zebrafischexperimente in dieser Studie wurden genehmigt (2019-A016-01) und wurden am Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, durchgeführt.
1. M. marinum Einzelzell-Inokulum-Vorbereitung (Abbildung 1)
- Cerulean-fluoreszierenden M. Marinumglycerinbestand aus -80 °C auftauen und eine 7H10-Agarplatte mit 10% (v/v) OADC, 0,25% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin impfen. Inkubieren Sie die Platte bei 32 °C für et....
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Ergebnisse
Mycobacterium-Infektion kann verschiedene Wirtsreaktionen basierend auf den Infektionswegen auslösen. In diesem Protokoll werden Zebrafischembryonen durch intramuskuläre Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in das Mittelhirn oder den Rumpf infiziert (Abbildung 3) und durch konfokale Live-Bildgebung beobachtet. Eine Infektion über diese beiden Routen wird die Infektion lokal einschränken, die angeborene Immunzellrekrutierung und den anschließenden Zelltod verursacht.
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung des Makrophagensterbens während einer mykobakteriellen Infektion. Basierend auf Faktoren wie der Integrität der Zellmembran kann der infektionsgetriebene Zelltod in Apoptose und lytischen Zelltod24,25unterteilt werden. Lytischer Zelltod ist für den Organismus stressiger als Apoptose, weil er eine starke Entzündungsreaktion auslöst 24,25. Die Beobachtung des l.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung von Zebrafischstämmen, Dr. Stefan Oehlers und Dr. David Tobin für die gemeinsame Nutzung der Ressourcen von M. marinum, Yuepeng He für die Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), dem Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) und Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018YQ54) (B.Y.) (B.Y.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL Spritze | Solarbio | YA0552 | |
| 10 % OADC | BD | 211886 | |
| 3-Aminobenzoesäure | Sigma | E10521 | |
| 5 μ m Filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μ l/ml Hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A Glasboden 35 mm Schale | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Konfokalmikroskop | Leica | TCS SP5 II | |
| Umweltkammer | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | Nr.5242956003 | |
| Glasmikroskop Objektträger | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Inkubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Mikroinjektionsnadel | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Mikroinjektor | Eppendorf | Femtojet | |
| Mikromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenolrot | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Einfacher konkaver Glas-Objektträger | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spektralphotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereomikroskop | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
Referenzen
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathw....
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Nachdrucke und Genehmigungen
