تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.
المقدمة
التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة1. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون2 بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين3. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة
- اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين(13C615N2-lysine) أو أرجينين (13C615N4- أرجينين).
- خلط الببتيدات الثقيلة، وتمييع المزيج مع 50٪ أسيتونيتريل (ACN) لإنشاء مزيج الببتيد مع كل الببتيد في 10 ميكرومتر.
- إنشاء aliquots من مزيج الببتيد وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. إعداد العينة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 100 mM MG-132 لمدة 4 ساعات قبل الحصاد. MG-132 هو مثبط بروتيسوم يمنع تدهور البروتينات المترافقة في كل مكان من قبل proteasome14. وبالنظر إلى ذلك ، فهو شرط اختبار مناسب لإثبات تحليل سلسلة ubiquitin. ويمكن ر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح هنا، له دور في مجموعة واسعة من التحقيقات البيولوجية.
وينبغي أن يفهم أن البروتوكول المبين هنا يوفر لمحة طوبولوجية عالمية. استخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى يسمح بتحديد الببتيدات التي كانت في كل مكان، ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يشكرا سيلين جانتي على مساعدتها في إنشاء الكريات الخلوية مع علاج MG-132 على النحو المبين في النتائج التمثيلية وإليز مومارتس على توفيرها لكريات الإشريكية القولونية المستخدمة في البروتوكول.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أسيتونيتريل (ACN) | ميرك | 100029 | |
| بيكربونات الأمونيوم (ABC) | فلوكا | 9830 | |
| جهاز طرد مركزي | بيكمان كولتر | ميكروفيوج 16 | |
| كلوروأسيتاميد (CAA) | سيجما | 22790 | |
| إيبندورف لوبيند | إيبندورف | 22431081 | |
| حمض الفورميك (FA) | ثيرمو فيشر ساینتيفيك | 85178 | |
| الببتيدات الثقيلة | JPT تقنيات | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC العمود | الحراري فيشر العلمي | 160321 | |
| Lys C Wako | 125-05061 | ||
| مطياف الكتلة | الحراري فيشر Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | سلسلة التحكم الإيجابية 156100050 | ||
| K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| سلسلة التحكم الإيجابية K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| سلسلة التحكم الإيجابية M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | برانسون سونيفير | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) | Sigam | T6508 | |
| تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) | ثيرمو فيشر Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters & Elution C18< / sub> لوحات | المياه | 186002318 |
المراجع
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
