Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.
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Artículo de método
Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas de unión al ARN y al ARN (RBP) controlan múltiples procesos biológicos. La disposición espacial y temporal de los ARN y los PBP subyace a la delicada regulación de estos procesos. Se ha desarrollado una estrategia llamada CLIP-seq (reticulación e inmunoprecipitación) para capturar interacciones endógenas entre proteínas y ARN con la reticulación UV seguida de inmunoprecipitación. A pesar del amplio uso del método CLIP-seq convencional en el estudio RBP, el método CLIP está limitado por la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad, contaminantes potenciales de los PBP copurificados, requisito de manipulación de isótopos y posible pérdida de información durante un procedimiento experimental tedioso. Aquí describimos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq usando la purificación en tándem de etiqueta flag-biotina. A través de la purificación en tándem y las condiciones de lavado estrictas, se eliminan casi todas las proteínas de unión al ARN que interactúan. Por lo tanto, los ARN que interactúan indirectamente mediados por estos PBP copurificados también se reducen. Nuestro método FBIoCLIP-seq permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin procedimientos de transferencia de membrana y SDS-PAGE de una manera libre de anticuerpos sin isótopos y específica de proteínas.
Introducción
Los ARN y las proteínas de unión al ARN (RRP) controlan diversos procesos celulares, incluyendo empalme, traducción, biogénesis ribosoma, regulación epigenética y transición del destino celular1,2,3,4,5,6. Los delicados mecanismos de estos procesos dependen de la disposición espacial y temporal única de los ARN y los RRP. Por lo tanto, un paso importante hacia la comprensión de la regulación del ARN a nivel molecular es revelar la información posicional sobre los sitios de....
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Protocolo
1. Construcción de líneas celulares
- Clonar el gen de interés en un plásmido pPiggyBac-FLAG-flag-bio-[cDNA de interés]-(resistente a la higromicina) que lleva un epitótopo FLAG-biotina13,21 para expresar una etiqueta FLAG-biotina fusionada RBP (FBRBP).
- Cotransfect the FBRBP express vector with the pBase vector into a cell line expressing the BirA enzyme22.
NOTA: En este estudio, el gen FBRBP fue trans infectado en células madre embrionarias de ratón (mESC) llevando un vector de expresión BirA integrado21. Alt....
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Resultados
La representación esquemática del procedimiento FBIoCLIP-seq se muestra en la Figura 1. En comparación con la purificación de afinidad de un solo paso mediada por FLAG o extiptavidina, la purificación en tándem FLAG-biotina eliminó casi todas las proteínas copuradas, evitando la contaminación de las interacciones indirectas proteína-ARN (Figura 2). Los resultados representativos de FbioCLIP-seq para LIN28 y WDR43 se muestran en
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Discusión
Aquí presentamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq, aprovechando el sistema de doble etiquetado FLAG-biotina para realizar la purificación en tándem de los complejos de proteína-ARN. El sistema de doble etiquetado FLAG-biotina ha demostrado ser potente en la identificación de las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN13,21. Aquí demostramos la alta especificidad y conveniencia de este sistema en la identificación de los ARN que.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El apoyo a las subvenciones es del Programa Nacional de Investigación Básica de China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630095) y el Centro de Ciencias de la Vida de la Universidad de Tsinghua.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipo | |||
| reticulante UV | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| afinidad Perlas de purificación | |||
| ANTI-FLAG | Beads Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Perlas de estreptavidina | Invitrogen | 112.06D | |
| Reactivos | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG péptido | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | está en el mismo paquete. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Kit de purificación de gel | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| trancriptasa inversa ( SupperScriptIII) | 18080093 | Invitrogen | |
| (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| Inhibidor de la ARNasa | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen 10777019 | ||
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | El tampón PNK está en el mismo paquete. |
| Ligas de ARN T4 | ThermoFisher | EL0021 | y BSA están en el mismo paquete. |
| La ARN ligasa2 T4, | el tampón de ARN ligasa T4 NEB M0242S truncado y el PEG al 50% están en el mismo paquete. | ||
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC medio de cultivo | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | proteína recombinante purificada; dilución de 10.000 veces | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Mezcla de nucleósidos (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicilina-Estreptomicina (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| gel | QIAGEN | 28704 |
Referencias
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin....
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Reimpresiones y permisos
