الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات الحية. لذلك ، يتم تصوير الغشاء المخاطي المعوي الملون موضعيًا (acriflavine و rhodamineB-dextran) من الفئران المُضنِع إلى دقة خلية واحدة باستخدام المجهر confocal.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نهج المجهر الداخلي القائم على تقييم نفاذية المعوية وخلية الظهارية ذرف الأداء
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسمح المجهر الداخلي للأمعاء باستخدام التصوير confocal الملاحظة في الوقت الحقيقي من سفك الخلايا الظهارية وتسرب الحاجز في الحيوانات الحية. ولذلك ، فإن الغشاء المخاطي المعوي للفئران المُجَنَّبة مُلطّخة موضعيًا بصبغ غير محدد (acriflavine) وتتبع فلوري (رودامين - ب ديكستران) ، مثبتًا على لوحة مشطفة بالمحلول الملحي ومصوّرة مباشرة باستخدام مجهر confocal. يمكن لهذه التقنية أن تكمل تقنيات أخرى غير الغازية لتحديد تسرب نفاذية الأمعاء، مثل مرور transmucosal من المقتفيات تدار شفويا. بالإضافة إلى هذا، النهج المعروض هنا يسمح بالمراقبة المباشرة للأحداث تسليط الخلية في الوقت الحقيقي. في تركيبة مع الفئران مراسل الفلورسنت المناسبة، وهذا النهج هو مناسبة لتسليط الضوء على الآليات الخلوية والجزيئية التي تتحكم في قذف الخلايا الظهارية المعوية، وكذلك لعمليات بيولوجية أخرى. في العقود الماضية، ساهمت دراسات مثيرة للاهتمام باستخدام المجهر داخل الرحم في المعرفة حول نفاذية الأمعاء البطانية، واتصال الأمعاء في الخلايا المناعية، والتواصل بين المناعة والظهارية، وغزو المكونات اللماحية، من بين أمور أخرى. معا، فإن البروتوكول المقدم هنا ليس فقط تساعد على زيادة فهم آليات التحكم في قذف الخلايا الظهارية، ولكن يمكن أيضا أن يكون أساسا للتنمية من النهج الأخرى لاستخدامها كأدوات لتصور عملية أخرى الخلوية ديناميكية للغاية، حتى في الأنسجة الأخرى. ومن بين القيود التقنية، فإن الخصائص البصرية للأنسجة المحددة، فضلا عن تكنولوجيا التصوير المختارة وتكوين المجهر، من شأنها أن تحدد بدورها مسافة عمل التصوير، ودقة الصور المكتسبة.
المقدمة
الأمعاء هي جهاز متخصص للغاية مع وظيفة منظمة بإحكام تمكين العمليات المتضاربة، وهي التغذية والحماية من المواد الإنارة الضارة. بطانة بين الجسم البشري والبيئة، وظهارة المعوية بمثابة حاجز المادية والمناعية ويساهم في الحفاظ على التوازن المخاطي في القناة الهضمية1،2. ومن المعروف جيدا فقدان النزاهة الظهارية وزيادة نفاذية تقاطع ضيق أن تكون مرتبطة مع مرض التهاب الأمعاء (IBD)3,4,5,6. ثم تعتبر التعديلات الظهارية كمسببات ومكبرات الصوت الثانوية لالتهاب الأمعاء المزمن في IBD. وهكذا، فإن تحسين فهم ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت السلطات المحلية المختصة في إرلانجن على البروتوكول التالي (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germany). تم إيواء الفئران في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.
ملاحظة: تثبيط قبلة GGTase بوساطة داخل IECs يسبب تغيير شديد في نفاذية الأمعاء في Pggt1bط ΔIEC الفئران24. لذلك، تم استخدام هذا النموذج الماوس لشرح كيف يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا لدراسة عيوب الحاجز المعوي. ومع ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أي خط الماوس الأخرى.
1. إعداد الجراحية والفأر الأمعاء تلطيخ الغشاء المخاطي
ملاحظة: يستند الإعداد الجراحي على البروتوكولات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يصف البروتوكول المعروض هنا نهجًا قائمًا على المجهر الداخلي لتصور تسرب الظهارة المعوية ومراقبة أداء سفك الخلايا في الأمعاء في الوقت الفعلي. باختصار ، يتم تخدير الفئران وتقديمها إلى التحضير الجراحي من أجل الكشف عن سطح الأمعاء الدقيقة المخاطية. ثم تلطخ IECs عن طريق تطبيق موضعي من acriflavine; بينما يستخدم اللمّبات اللمّة اللمّة (اللمّة) (اللمّة) إلى الفضاء دون الظهارية كمتتبعات. وهكذا، يتم وضع الإعداد الجراحي والفأرة المُقنَّة على شريحة مثبتة في طبق بيتري وتُصوَّر بمرور الوقت باستخدام CLSM (.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن تحديا من الناحية الفنية، منهجية تستند إلى المجهر intravital يمثل نهجا تجريبيا فريدة من نوعها لتصور دينامية عالية عملية الخلوية في الوقت الحقيقي، مثل سفك الخلية الأداء. حتى الآن، لا يوجد نهج تجريبي بديل لتصور البثق الخلية في الجسم الحي. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن تسهم في وصف العمليات الخلوية المتنوعة التي تلعب دورا في الحفاظ على التوازن المعوي.
الاستفادة من المجهر داخل مدينة، طريقة المقدمة هنا تمكن التصور في الوقت الحقيقي من الظهارية الأمعاء سفك الخلايا في الحيوانات ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلاً من برنامج الأشخاص (Marie Curie Actions) بموجب اتفاقية منحة REA رقم 302170 من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013)؛ مركز البحوث السريرية المتعدد التخصصات (IZKF) التابع لجامعة إرلانغن - نورمبرغ؛ مركز البحوث التعاونية TRR241 ومجموعة البحوث السريرية KFO257 من مجلس البحوث الألماني (DFG)؛ وDFG.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول أكريفلافين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | A8251 | 1 مجم / مل في |
| وسادة متساوية الحرارة في PBS Deltaphase وسادة متساوية الحرارة | BrainTree | B-DP-PAD-Gemini | |
| نظام الكي | BrainTree | B-GEM-5917-Ketamin | |
| WDT | 9089.01.00 | ||
| LAS X | Leica | - | |
| مجهر LSM SP8 | Leica | - | |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextران | Invitrogen | D1824 | 10،000 kDa MW ؛ محلول 2 مجم / مل |
| ملقط قياسي (Dumont SS) | أدوات العلوم الدقيقة | 11203-23 | |
| مقص ناعم مستقيم | أدوات العلوم الدقيقة | 14060-10-Tamoxifen | |
| Sigma Aldrich | T5648 | 50 مجم / مل في الإيثانول | |
| زيلازين | باير | 1320422 |
المراجع
- Buhner, S., et al. Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation? Gut. 55 (3), 342-347 (2006).
- Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
