여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.
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이 논문에서
요약
초록
클로스트리디오이드 디피실 감염(CDI)은 미국에서 가장 흔한 의료 관련 위장 감염 중 하나로 간주됩니다. C. difficile에 대하여 타고난 면역 반응은 기술되었습니다, 그러나 CDI에 있는 호중구 및 대식세포의 정확한 역할은 보다 적게 이해됩니다. 현재 연구에서는, Danio rerio (zebrafish) 애벌레는 생체 내에서 이러한 선천적 면역 세포의 행동과 협력을 이미징하기 위한 C. difficile 감염 모델을 확립하는 데 사용됩니다. C. difficile을모니터링하기 위해 형광 염료를 사용하는 라벨링 프로토콜이 확립되었습니다. 국소화된 감염은 제브라피시 장관에서 활발하게 자라며 CDI의 장 상피 손상을 모방하는 C. difficile이라는 라벨이 붙은 마이크로주입에 의해 달성됩니다. 그러나, 이 직접적인 감염 프로토콜은 침략적이고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 현미경 상처를 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 더 비침습적 마이크로게이지 프로토콜은 여기에 기술된다. 이 방법은 열린 입을 통해 삽관에 의해 제브라피시 유충의 장으로 직접 C. difficile 세포의 전달을 포함한다. 이 감염 방법은 C. difficile의자연 감염 경로를 밀접하게 모방합니다.
서론
C. difficile는 그람 양성, 포자 형성, 혐기성 및 위장관에서 의 심한 감염의 주요 원인인 독소 생성 간균1. CDI의 전형적인 현상은 설사, 복부 고통 및 치명적인 pseudomembranous 대장염을 포함하고, 때때로 죽음으로 이끌어 낼 수 있습니다1,2. 증거는 호스트 면역 반응이 이 질병의 진행 그리고 결과 둘 다에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다3. 면역 반응 이외에, 토착 창자 microbiota는 CDI4의개시 그리고 병인을 위해 결정적이다. 지난 10 년 동안, CDI의 케이스의 수와 사망률은 C. difficile (BI/NAP1/027)의 hypervirulent 긴장의 출현 때문에 현저하게 증가했습니다5,6. 근본적인 면역 기계장치의 더 나은 이해 및 CDI 도중 microbiota의 역할은 이 전염병의 더 나은 통제를 가능하게 하는 새로운 치료 발달 및 어드밴스로 이끌어 낼 것입니....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 동물 작업은 법적 규정(EU-지침 2010/63, 라이센스 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 및 라이센스 AZ 33.9-42502-04-14/1418)에 따라 수행되었습니다.
1. 저융액 아가로즈, 젤 플레이트 및 미세 주입 /미세 가게이 지 바늘의 준비
- 용해 0.08 g의 저용융 아가로즈(재료표,아가로즈 A2576) 10 mL의 30% 다니요 배지 (0.12 mM MgSO4,0.18 mM Ca [NO3]2),0.21 mM KCl, 1.5 mM HEPES (pH = 7.2), 및 17.4 mM NaCl, 0.8 % 용액을 얻기 위해 실온 (RT)에 저장.
참고: 아가로즈농도가 높거나 낮게 사용하실 수 있습니다. 그러나, 고형화 하는 데 필요한 시간은 아가로즈의 다른 브랜드에 대 한 변화, 심지어 동일한 농도에서. - 유리 모세 혈관에서 미세 주입 및 미세 가게이 바늘을 준비하십시오(재료 표).
- 다음 설정으로 마이크로파이펫 풀러를 사용하십시오 (단위는 여기에 사용되는 풀러에 특정합니다. 재료 표참조): 미세 사출 바늘 (....
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결과
C. difficile는 엄격하게 혐기성입니다, 그러나 형광성 단백질의 발색단은 일반적으로 성숙하기 위하여 산소를 요구합니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 형광염료를 활발히 성장시킨 살아있는 C. 디피실 세포를 염색하는 데 사용되었다(R20291, 리보형 027 균주; 그림 1A). Gal4/UAS 시스템을 사용하여, mpeg1.1 또는 lyZ 프로모터가 Gal4 의존적 방식으로 대식세포 및 호중구(각각)에서 EGFP 형광 단백질의 발현을 유도하는 살아있는 이미징을 위해 안정적인 형질전환 제브라피시 라인이 생성되었습니다.
염색된 C. 디피실을 5 dpf에서 제브라피쉬 장관내로 주입하고, 감염된 부위를 1시간 배양 후에 이미지화시켰다. 시간 경과 화상 진찰은 호중구와 대식세포 둘 다 감염 사이트에 도달했다는 것을 보.......
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토론
제시된 방법은 주사 및 마이크로게이지10,14를모두 수행함으로써 제브라피시 유충을 감염시키기 위한 기존의 접근법을 수정하고 확장한다. 또한 제브라피시 유충22를사용하여 혐기성 병원체를 연구하는 접근법을 입증한다. 또한, 이 프로토콜은 CDI시 및 제브라피시에서 C. 디피실의 식민지화 시 생체 내 선천성 면역 세포 반응의 분석을 용이하게 한다. 이 방법은 재현 가능하고 일상적인 실험실 또는 임상 환경에서 수행하기 쉽습니다.
백혈구에 의한 C. 디피실의 식세포증을 모니터링하기 위해, 두 개의 안정적인 형질전환 제브라피쉬 라인(예를 들어, Tg[mpeg1.1: KalTA4] bz16)을 사용하여 대식세포(KalTA4: 제브라피쉬에 최적화된 Gal4-variant)와 Tg(lyz:KalTA4).......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
우리는 훌륭한 동물 관리를 위한 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 Köster와 Steinert 연구소의 회원들에게 지원과 도움이 되는 토론에 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 한단 박사께 감사드립니다. 우리는 감사하 중 낮은 작센의 연방 국가에 의해 자금 을 인정, 니더샤치쉬 보랍 (VWZN2889).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가 로스 | Sigma-Aldrich | A2576 | 초저 겔화 아가로 스 |
| 아가 로스 저융점 (LM) | Pronadisa | 8050 | 아가로 스 플레이트에 사용됩니다 |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | 형광 염료 |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (야생형) | 멜라닌 합성이 부족하여 안정적인 형질전환 라인을 생성하는 데 사용됨 | ||
| 질산칼슘(Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | 주사 바늘 |
| Clostridioides difficile | R20291,, 리보타입 027 균주, TcdA+/TcdB+/CDT+ 생산 | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | 오픈 소스 플랫폼 | 이미지 처리 | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| 수평 니들 풀러 | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-시스테인 | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | 이미지 처리 | |
| 황산마그네슘(MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| 마이크로 인젝터 | 에펜도르프 | 5253000017 | |
| 미세 사출 금형 | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 컨포칼 현미경 | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| 염화칼륨(KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| 타우로콜레이트 | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable 형질전환 계통에서 lyZ 프로모터가 호중구 | ||
| 에서 EGFP 형광 단백질의 발현을 주도합니다.Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | 안정적인 형질전환 라인에서 mpeg1.1이 대식세포에서 EGFP 형광 단백질의 발현을 주도 | ||
| 카인 | 시그마-알드리치 | E10521 | |
| 효모 추출물 | BD Bacto | 212750 |
참고문헌
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al.
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재인쇄 및 허가
