Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.
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Methodenartikel
Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerke (LNT) stellen ein In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Transports und der Lipidbiophysik dar, das für die ubiquitären Lipidtubuli in eukaryotischen Zellen relevant ist. In-vivo-LNTs sind jedoch stark ungleichgewichtsgleiche Strukturen, die chemische Energie und molekulare Motoren erfordern, um zusammengesetzt, aufrechterhalten und reorganisiert zu werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung von in vivo LNTs komplex und besteht aus mehreren verschiedenen Lipidspezies. Typische Methoden zum Extrudieren von LNTs sind sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv und erfordern optische Pinzetten, Mikroperlen und Mikropipetten, um Nanoröhrchen gewaltsam aus riesigen Lipidvesikeln zu ziehen. Hier wird ein Protokoll für den Gleitmotilitätsassay (GMA) vorgestellt, bei dem großflächige LNT-Netzwerke schnell aus riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) unter Verwendung von Kinesin-betriebener Mikrotubuli-Motilität erzeugt werden. Mit dieser Methode werden LNT-Netzwerke aus einer Vielzahl von Lipidformulierungen gebildet, die die Komplexität biologischer LNTs nachahmen, was sie für In-vitro-Studien der Lipidbiophysik und des membranassoziierten Transports immer nützlicher macht. Darüber hinaus ist diese Methode in der Lage, LNT-Netzwerke in kurzer Zeit (<30 min) mit gängigen Laborgeräten zuverlässig herzustellen. LNT-Netzwerkeigenschaften wie Länge, Breite und Lipidpartitionierung sind ebenfalls abstimmbar, indem die Lipidzusammensetzung der GUVs, die für die Herstellung der Netzwerke verwendet werden, geändert wird.
Einleitung
Die Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken (LNT) ist von zunehmendem Interesse für die In-vitro-Untersuchung von Nichtgleichgewichtslipidstrukturen 1,2,3. Zellen verwenden Lipidtubuli für den diffusiven Transport der Proteine4 und Nukleinsäuren5 sowie für die Zell-zu-Zell-Kommunikation 6,7. Das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat sind besonders interessant, da diese membrangebundenen Organellen die primären Orte für die Lipid- und Proteinsynthese sowi....
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Protokoll
1. Herstellung von Stamm-Mikrotubuli-Lösungen
ACHTUNG: Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel sollten während des gesamten Protokolls immer getragen werden.
- 5x BRB80-Puffer vorbereiten: 24,19 g PIPES (Piperazin-N,N′-bis[2-Ethansulfonsäure]) und 0,38 g EGTA (Ethylenglykol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure) in eine 1 L Glasflasche geben. Fügen Sie 1 ml 1 M MgCl2 hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,9 ein. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Lösung auf ein Endvolumen von 500 ml zu bringen.
- Bereiten Sie 100 mM Vorrat an GTP-Lösung vor: Wiegen Sie 52 mg GTP und suspendieren ....
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Ergebnisse
LNT-Netzwerke (Abbildung 4) wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt, das die Arbeit des Kinesin-Transports von Mikrotubuli verwendet, um LNTs aus GUVs zu extrudieren. Kurz gesagt, GUVs wurden unter Verwendung von Agarosegel-Rehydratation unter Verwendung von Saccharoselösung hergestellt, und Mikrotubuli wurden in GPEM-Lösung polymerisiert und in BRB80T stabilisiert. Als nächstes wurden Kinesin-Motoren in eine Durchflusszelle eingeführt, die eine aktive Schicht von Mo.......
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Diskussion
LNT-Netzwerke sind ein nützliches Werkzeug für In-vitro-Studien zu Membraneigenschaften und dem Transport von Biomolekülen wie Transmembranproteinen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung komplexer Lipidformulierungen zur Herstellung von LNT-Netzwerken biologisch relevantere Studien. Andere Herstellungsstudien haben entweder 1) einfache Lipidformulierungen und mehrfeldrige Vesikel oder 2) umständlichere Motilitätstechniken verwendet, um Netzwerke aus GUVs herzustellen, die aus komplexen Lipidformulierungen bestehen. D.......
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Offenlegungen
Sandia National Laboratories ist ein Multimissionslabor, das von National Technology & Engineering Solutions of Sandia, LLC., einer hundertprozentigen Tochtergesellschaft von Honeywell International, Inc., für die National Nuclear Security Administration des US-amerikanischen DOE unter Vertrag DE-NA-0003525 verwaltet und betrieben wird. Dieses Papier beschreibt objektive technische Ergebnisse und Analysen. Alle subjektiven Ansichten oder Meinungen, die in dem Papier zum Ausdruck gebracht werden könnten, stellen nicht unbedingt die Ansichten des US-Energieministeriums oder der Regierung der Vereinigten Staaten dar.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-) unterstützt. Kinesinsynthese und Fluoreszenzmikroskopie wurden im Rahmen eines Nutzerprojekts (ZIM) am Center for Integrated Nanotechnologies durchgeführt, einer Office of Science User Facility, die für das Office of Science des US-Energieministeriums (DOE) betrieben wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100x/1.4 Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Ölobjektiv unendlich korrigiert, RMS Gewinde Arbeitsabstand 0,12 mm |
| 3,0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosin 5′-triphosphat) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 Filterset | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000< | br/> BrightLine Pinkel Filterset, optimiert für DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 und andere ähnliche Fluorophore, beleuchtet mit LED-basierten Lichtquellen |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Caseinhydrolysat für die Mikrobiologie |
| Katalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Katalase aus Rinderleber |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | wasserfreies Chloroform enthält 0,5-1,0% Ethanol als Stabilisator |
| Cholesterin | Avanti | 700000P | Cholesterin (Schafwolle, >98%) (Pulver) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glukosepulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur, geeignet für Insektenzellkultur, geeignet für pflanzliche Zellkultur, ≥ 99,5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (in Chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl) (Natriumsalz) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (pulver) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl) (Natriumsalz) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol Lösung 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazinsäure, Ethylen-bis(oxyethylenenitrilo)tetraessigsäure, Glykoletherdiamintetraessigsäure, |
| Glukoseoxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glukoseoxidase aus Aspergillus niger Typ II, ≥ 10.000 Einheiten/g Feststoff (ohne Zusatz von Sauerstoff) |
| Glycerin | Fisher | G33 | Glycerol (zertifiziert ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosin 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Mikroskop | Olympus | N/A | IX81 Inverses Mikroskop von Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Kalium Hydroxid |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M1028 | 1,00 M Magnesiumchlorid Lösung |
| Orca Flash 4.0 Digitalkamera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS Kamera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol-Äquivalent) - nur zur Verwendung in der Forschung |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazindiethansulfonsäure, Piperazin-1,4-bis(2-ethansulfonsäure), Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure |
| Tubulin, Biotin | Zytoskelett | T333P | Tubulin Protein (Biotin) Schweinehirn |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Zytoskelett | TL488M | Tubulin Protein (fluoreszierend HiLyte 488) Schweinehirn |
| Tubulin, unmarkiertes | Zytoskelett | T240 | Tubulin Protein Schweinehirn |
Referenzen
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
