يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لإنتاج شرائح الكبد الدقيقة القابلة للتطبيق من الفئران. يمكن الحفاظ على عينات الأنسجة الجسمية السابقة في ظل ظروف زراعة الأنسجة المختبرية لعدة أيام ، مما يوفر نموذجًا مرنًا لفحص أمراض الباثوبيولوجيا الكبدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المورين الدقة قطع شرائح الكبد كنموذج السابق فيفو بيولوجيا الكبد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فهم آليات إصابة الكبد، والتليف الكبدي، وتليف الكبد التي تكمن وراء أمراض الكبد المزمنة (أي التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية، وأمراض الكبد الأيضية، وسرطان الكبد) يتطلب التلاعب التجريبي نماذج الحيوانات وثقافات الخلايا المختبرية. كلا الأسلوبين لها قيود ، مثل متطلبات أعداد كبيرة من الحيوانات للتلاعب في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تستنسخ الخلايا المختبرية بنية ووظيفة البيئة الكبدية متعددة الخلايا. استخدام شرائح الكبد بدقة قطع هو تقنية التي يتم الحفاظ على شرائح موحدة من كبد الماوس قابلة للحياة في زراعة الأنسجة المختبرية للتلاعب التجريبي. تحتل هذه التقنية مكانة تجريبية موجودة بين الدراسات الحيوانية وأساليب زراعة الخلايا المختبرية. يصف البروتوكول المقدم طريقة مباشرة وموثوقة لعزل وزراعة شرائح الكبد الدقيقة من الفئران. وتطبيقا لهذه التقنية، يتم التعامل مع شرائح الكبد الجسم الحي السابق مع الأحماض الصفراوية لمحاكاة إصابة الكبد cholestatic وتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية في نهاية المطاف.
المقدمة
الإمراض من أمراض الكبد المزمنة معظم (أي التهاب الكبد الفيروسي، والتهاب الكبد غير الكحولية، وإصابة الكبد cholestatic وسرطان الكبد) ينطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع خلايا الكبد المختلفة المتعددة التي تدفع الالتهاب، والتولد الليفي، وتطور السرطان1،2. لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأمراض المزمنة القائمة على الكبد، يجب التحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد المتعددة. في حين أن خطوط الخلايا الكبدية المتعددة (ومؤخرا، organoids) يمكن أن تكون مثقفة في المختبر، وهذه النماذج لا تحاكي بدقة بنية معقدة، وظيفة، والتنوع الخلوي للبيئة الدقيقة الكبدية3. وعلاوة على ذلك، فإن خلايا الكبد المستزرعة (على وجه الخصوص، خطوط الخلايا المتحولة) قد تنحرف عن بيولوجيا مصدرها الأصلي. وتستخدم نماذج الحيوانات تجريبيا للتحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد متعددة. ومع ذلك، قد تصبح منخفضة بشكل كبير في نطاق التلاعب التجريبي، وذلك بسبب آثار كبيرة خارج الهدف في الأعضاء خارج الكبد (على سبيل المثال، عند اختبار العلاجات المحتملة).
استخدام شرائح الكبد الدقيقة القطع (PCLS) في زراعة الأنسجة هو تقنية تجريبية استخدمت لأول مرة في دراسات استقلاب المخدرات وسميتها، وهي تنطوي على قطع شرائح الكبد القابلة للحياة وفائقة النحافة (حوالي 100-250 ميكرومتر) . هذا يسمح التلاعب التجريبي المباشر من أنسجة الكبد السابقين الجسم الحي4. هذه التقنية الجسور الفجوة التجريبية بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وطرق زراعة الخلايا في المختبر ، والتغلب على العديد من العيوب من كلا الطريقتين (أي ، حدود عملية على مجموعة من التجارب التي يمكن القيام بها في الحيوانات كلها ، فضلا عن فقدان الهيكل / وظيفة والتنوع الخلوي مع أساليب زراعة الخلية المختبرية).
وعلاوة على ذلك، يزيد PCLS بشكل كبير من القدرة التجريبية مقارنة بالدراسات الحيوانية الكاملة. كما يمكن أن تنتج ماوس واحد أكثر من 48 شرائح الكبد، وهذا يسهل أيضا استخدام كل من مجموعات التحكم والعلاج من نفس الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه التقنية فعليًا أنسجة الكبد عن أنظمة الأعضاء الأخرى . لذلك ، فإنه يزيل الآثار المحتملة خارج الهدف التي يمكن أن تحدث في الحيوانات بأكملها عند اختبار آثار المحفزات الخارجية.
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء PCLS باستخدام هزاز مع شفرة تهتز بشكل طولاني. وقد استخدمت دراسات أخرى بنجاح تقطيع الأنسجة Krumdieck، كما هو موضح في أولينغا وشوبان5. في الهزاز ، يمنع الاهتزاز الجانبي للشفرة تمزق الأنسجة فائقة النحافة الناجمة عن إجهاد القص ، حيث يتم دفع النصل إلى الأنسجة. يعمل كل من الهزاز وتقطيع الأنسجة Krumdieck بشكل فعال دون التضمين الهيكلي لأنسجة الكبد ، مما يبسط إجراء التقطيع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لإنشاء PCLS من الكبد المريضة، بما في ذلك تلك من نماذج الماوس من التليف / تليف الكبد6 والتهاب الكبد7.
بالإضافة إلى إظهار التقنيات اللازمة لإعداد وزراعة الأنسجة من PCLS، وهذا التقرير يدرس أيضا صلاحية هذه الأنسجة الجسم الحي السابقين عن طريق قياس مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وفحص أنسجة الأنسجة لتقييم نخر والتليف. كإجراء تجريبي تمثيلي ، يتم التعامل مع PCLS بتركيزات فيزيولوجية ثلاثية من ثلاثة أحماض صفراء مختلفة (glycocholic ، taurocholic ، والأحماض التشوليك) لمحاكاة إصابة الكبد الالمرارة. في سياق إصابة الكبد التشوستاتيكي ، ثبت أن حمض الطوروكوليك على وجه الخصوص قد زاد بشكل كبير في كل من المصل والصفراء للأطفال الذين يعانون من التليف الكيسي المرتبط بمرض الكبد8.
كما تم علاج خلايا ذرية الكبد في المختبر مع حمض التاوروشوليك لمحاكاة مستويات حمض التاوروشوليك المرتفعة التي لوحظت في المرضى ، وتسبب هذا العلاج في زيادة انتشار وتمايز خلايا ذرية الكبد نحو نمط فينوتاي (cholangiocyte) الصفراري (cholangiocyte)9. وفي وقت لاحق، عولجت الـ PCLS بالجسم الحي السابق بمستويات مرتفعة من حمض الطوروكوليتش، ولوحظت علامات الكولينجيوسيتي المتزايدة. وهذا يدعم الملاحظة المختبرية أن حمض الطوروتشوليك يدفع الانتشار الصفراري و / أو التمايز في سياق مرض الكبد المرتبط بالتليف الكيسي للأطفال9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمدونة الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها للأغراض العلمية في معهد البحوث الطبية QIMR Berghofer بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات في المعهد. تم الحصول على ذكور فئران C57BL/6 (15-20 أسبوعاً) من مركز الموارد الحيوانية، غرب أستراليا.
ملاحظة: يجب تعقيم جميع الحلول والوسائط والأدوات والأجهزة والأنابيب التي تتصل بالعينات أو تطهيرها تمامًا باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 70٪ والتعامل معها باستخدام تقنيات معقمة لتقليل خطر تلوث الثقافة.
1. إعداد الهزاز
- إعداد محلول العازلة كريبس-Henseleit المعقم مع 2 غرام / لتر الجلوكوز(جدول المواد). تأكد من أن درجة الحموضة للمخزن المؤقت هو 7.4. إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى, تشبع المخزن المؤقت مع carbogen (95% O2 + 5% CO2)أو احتضان داخل 5% CO2 حاضنة زراعة الأنسجة لتصحيح نظام التخزين المؤقت بيكربونات. قم بتبريد المحلول العازل المعقم المختوم عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- أدخل شفرة الهزاز في ذراع القطع. تأكد من أن النصل ثابت بإحكام على ذراع القطع ، حيث يمكن أن تتسبب الاهتزازات في أن يكون النصل فضفاضًا.
- تطهير شفرة وقطع الذراع مع محلول الإيثانول 70٪.
تنبيه: تجنب ملامسة النصل. - تطهير علبة عازلة مع محلول الإيثانول 70٪ ومسحه بأنسجة معقمة.
- أدخل علبة المخزن المؤقت في الهزاز وتشديد آلية التركيب.
- تعيين ذراع القطع إلى أقصى ارتفاع متاح.
- تعيين زاوية شفرة إلى 10 درجة تحت الأفقي، المنحدرة إلى أسفل إلى العينة. تأكد من أن زاوية النصل ثابتة بإحكام.
ملاحظة: قد تختلف زاوية النصل المثلى اعتمادًا على نموذج الهزاز وخصائص الأنسجة. - تطهير حامل العينة مع محلول الإيثانول 70٪.
- قم بتوصيل مياه التبريد لمبرد بلتييه الحراري الموجود تحت الدرج العازل.
ملاحظة: تستخدم بعض نماذج الهزاز حمام ثلج للتبريد بدلاً من ذلك. - إصلاح أنبوب المياه التدريجي إلى استنزاف وتحويل المياه. تعيين برودة إلى 4 درجة مئوية. تشغيل مياه التبريد بمعدل أكثر من 400 مل / دقيقة.
- ملء علبة عازلة تقريبا إلى الأعلى مع الثلج الباردة المعقمة كريبس-Henseleit العازلة (مع 2 غرام / لتر الجلوكوز). ترك إضافية كريبس-Henseleit حل عازلة على الجليد.
2. إزالة الكبد وإعداد
- تعقيم أو تطهير جميع الأدوات الجراحية بما في ذلك ملقط المنحني، ملقط مربع ة مسطحة، ملاقط، المشابك الجراحية، ومقص باستخدام الأوتوكلاف.
- قبل إزالة الكبد، وحقن الفئران بعمق باستخدام حقن داخل البلغ100 ملغ/كغ الكيتامين و 12.5 ملغ/كغ xylazine.
ملاحظة: يمكن استخدام مخدر آخر، أو يمكن أن تكون الفئران القتل الرحيم عن طريقثاني أكسيد الكربون الاختناق / خلع عنق الرحم إذا تمت إزالة الكبد بسرعة لمنع الضرر الناجم عن نقص الأكسجة. - تطهير أسطح الجلد على الفئران عن طريق التبول مع محلول الإيثانول 70٪. الفئران آمنة على ظهورهم مع جميع الأطراف المثبتة على لوحة تشريح.
- جعل شق خط الوسط العمودي في الجلد من قاعدة تجويف البطن إلى أعلى الحجاب الحاجز.
ملاحظة: يتم إجراء شقوق نحو الأطراف لتسهيل التراجع عن الجلد. - سحب الجلد مرة أخرى في حين قطع أي النسيج الضام بين الجلد وتجويف البطن. منع نقل الشعر إلى تجويف البطن قدر الإمكان. دبوس أو المشبك الجلد بعيدا عن تجويف البطن.
- باستخدام ملقط نظيفة ومقص، وفتح تجويف البطن وانخفاض تجويف الصدر.
- إزالة الكبد بسرعة دون الإضرار الفصوص
- باستخدام أدوات حادة (على سبيل المثال، ملقط مربع الحافة المسطحة)، دليل الفصوص الكبد العلوي إلى أسفل نحو البطن. قطع النسيج الضام المحيطة فصوص الكبد العلوي باستخدام مقص.
- توجيه فصوص الكبد صعودا نحو الحجاب الحاجز. عقد حزمة الأوعية الدموية المركزية من الكبد مع ملقط.
ملاحظة: لن يؤثر على الإجراء إذا تضررت حزمة الأوعية الدموية المركزية. - سحب حزمة الأوعية الدموية المركزية بعيدا عن الماوس وقطع النسيج الضام المتبقية، والأوعية الدموية، وما إلى ذلك لإزالة الكبد. الحرص على عدم 1) تلف فصوص الكبد و 2) قطع في الجهاز الهضمي، وهذا قد تلوث الكبد مع الكائنات الحية الدقيقة.
- ضع الكبد الذي تمت إزالته في طبق تعقيمي لاستزراع الأنسجة بطول 10 سم نصف مملوء بمحلول العازلة كريبس-هينسلِت البارد. باستخدام أداة حادة لتوجيه الفصوص، وقطع مركز الكبد لتقسيمه إلى فصوص منفصلة.
- حدد فص كبد واحد (استخدم الجزء الأكبر أولاً)، وضعه مسطحاً إلى أسفل على طبق جديد معقم بطول 10 سم. الحفاظ على جميع فصوص الكبد الأخرى في طبق من محلول العازلة كريبس-Henseleit المخزنة على الجليد للاستخدام اللاحق.
- تقليم حوالي 10٪ من المواد من أطول حافة من فص الكبد في حين الكذب شقة.
ملاحظة: التشذيب مهم، لأن حافة الأنسجة هذه ستتصل بشفرة القطع أولاً؛ لذلك ، فإن حافة الأنسجة التي هي عمودي نسبيًا على شفرة القطع ستمنع ضغط الأنسجة الذي يمكن أن يحدث بسبب الزوايا الضحلة في فصوص الكبد غير المصقولة. - تقليم حواف الأنسجة الثلاثة الأخرى.
ملاحظة: هذا يزيل بعض كبسولة غليسون الليفية وسيجعل فصل شرائح الأنسجة أسهل. - تركيب فص الكبد على حامل العينة
- ضع طبقة رقيقة من الغراء السيانواكريلات (الغراء الفائق أو الغراء الطبي / البيطري الصف سيانواكريلات) على حامل العينة نحو الجبهة، وحجم أكبر قليلا من فص الكبد قلصت.
ملاحظة: تأكد من أن الغراء السيانواكريلات لا يحتوي على إضافات غير سيانواكريلات. - التقط فص الكبد برفق مع ملقط معقم باستخدام زاوية بعيدًا عن حافة القطع ، ثم قم بتجفيف أي عازلة متبقية من الجانب المسطح من فص الكبد باستخدام مواد ماصة معقمة.
- ضع الجانب المسطح الكبير من فص الكبد على رقعة الغراء السيانواكريلات مع أكبر حافة تواجه نحو الأمام. السماح لها لعلاج في الهواء لمدة 1-2 دقيقة.
ملاحظة: المواد اللاصقة السيانواكريلات علاج بسرعة (~ 2 دقيقة) استجابة لبروتينات الرطوبة والأنسجة المتبقية، وأنها سوف نعلق بحزم الأنسجة إلى حامل العينة.
- ضع طبقة رقيقة من الغراء السيانواكريلات (الغراء الفائق أو الغراء الطبي / البيطري الصف سيانواكريلات) على حامل العينة نحو الجبهة، وحجم أكبر قليلا من فص الكبد قلصت.
3. إنتاج شرائح الكبد
- ضع حامل العينة مع فص الكبد المرفق في صينية العازلة الهزاز. تأكد من تغطية فص الكبد بالكامل بواسطة المخزن المؤقت.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، ارفع مستوى محلول العازلة كريبس-هينسيليت الباردة. إذا كان مستوى المخزن المؤقت يحجب عملية القطع، قم بزيادة المستوى أو إنقاصه. - ضبط سرعة القطع.
ملاحظة: قد يحتاج هذا إلى تحديد تجريبي احسب نموذج الهزاز وخصائص النصل. كدليل بدء، استخدم سرعة 57 هرتز/3,420 دورة في الدقيقة. يمكن قياس سرعة الهزاز باستخدام تطبيق محلل الطيف الصوتي على الهاتف الذكي. - خفض شفرة القطع حتى يقع فقط فوق فص الكبد باستخدام ارتفاع الطلب. تشغيل ذراع القطع تهتز على العينة.
- عودة شفرة مرة أخرى باستخدام مقبض كرنك في الاتجاه المعاكس. تنشيط الاهتزازات أثناء إرجاع النصل. بعد أن عاد النصل وليس فوق العينة، خفض ارتفاع شفرة من قبل 250 ميكرون.
- كرر عملية القطع حتى تتم إزالة الجزء العلوي من الأنسجة. تجاهل أول شريحة أو شريحتين ، لأن هذه ستحتوي على كبسولة غليسون وبالتالي لا تحتوي على الكثير من أنسجة الكبد الوظيفية مقارنة بشرائح أخرى.
- لقطع شرائح الكبد، تقدم ببطء شفرة تهتز في الأنسجة عن طريق تحويل مقبض. استخدام فرشاة الطلاء الصغيرة (تطهيرها مع محلول الإيثانول 70٪) لتوجيه بلطف الأنسجة أثناء عملية القطع.
- استخدام فرشاة الطلاء لرفع شرائح الأنسجة قطع ووضع شريحة الأنسجة في أنبوب معقم من الجليد الباردة كريبس-Henseleit العازلة. عندما لا تكون في الاستخدام، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد بين شرائح.
ملاحظة: في بعض الأحيان، الأنسجة لا المسيل للدموع أثناء عملية القطع، ولكن بالنسبة لمعظم الأغراض الأنسجة لا تزال صالحة للاستخدام. - كرر عملية القطع حتى يتم الوصول إلى قاعدة فص الكبد. تجاهل أي شرائح الكبد التي لديها الغراء الشفاء مرئية.
ملاحظة: الغراء الشفاء مرئية كمناطق بيضاء على شرائح الأنسجة. سوف يكون الفص الكبد نموذجي فقط سمك صالحة للاستعمال من حوالي 2 ملم. لذلك ، يتم إنتاج حوالي ثماني شرائح كبد 250 ميكرومتر فقط من كل فص. - قطع شرائح الأنسجة حتى بالقرب من الغراء سيانواكريلات. لا تقطع في الغراء.
- كرر العملية برمتها مع فصوص الكبد الأخرى حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من شرائح الأنسجة.
- لتنظيف الغراء السيانواكريلات الشفاء والأنسجة من حامل العينة، إما استخدام شفرة لكشط الغراء الشفاء / خليط الأنسجة قبالة، أو تليين وتنظيف الخليط مع الأسيتون أو ثنائي ميثيل sulfoxide.
4- زراعة الأنسجة
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع أعمال زراعة الأنسجة في غطاء تدفق لامير العقيمة.
- في غطاء تدفق اللاصفي ثقافة الأنسجة, ماصة 1 مل من المتوسطة E وليام التي تحتوي على 2.0 غرام / لتر الجلوكوز, 10% مصل الأبقار الجنين (FBS), 2 mM L-غلوتامين الملحق, 100 U/mL البنسلين, و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوموسين في 12 لوحات زراعة أنسجة الآبار.
ملاحظة: يمكن أيضًا إضافة مضادات حيوية أخرى وعوامل مضادة للفطريات. وقد استخدمت بعض الدراسات إضافات في وسط حضانة الأنسجة (أي ديكساميثازون والأنسولين10)، ولكن هذه يمكن أن تتداخل مع إشارات الخلية. - ضع الأنبوب الذي يحتوي على شرائح كبد من الثلج في غطاء زراعة الأنسجة. لإزالة شرائح الأنسجة، دوامة بلطف الخليط وتلميح بلطف في طبق معقم 10 سم في حين يحوم.
- باستخدام ملقط حادة النقطة معقمة ومشرط، وقطع شرائح الأنسجة إلى أحجام موحدة تقريبا (على سبيل المثال، 15 ملم2).
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لضمان مساحة سطح متناسقة. لأن فصوص كبد الماوس تختلف اختلافا كبيرا في الحجم وبعض شرائح الأنسجة سوف المسيل للدموع، وهذا سوف تنتج مجموعة من PCLS مع مناطق سطحية مختلفة. تعتمد أحجام المساحة السطحية النهائية لـ PCLS على كمية المواد المطلوبة في تطبيقات التحليل اللاحقة وعدد مرات التكرار المطلوبة. قطع PCLS كبيرة إلى قطع متعددة أصغر من نفس الحجم التقريبي سوف تسمح بالفطرة عدد متزايد من يكرر التجريبية. - باستخدام ملقط معقم أو فرشاة طلاء صغيرة، نقل شرائح الأنسجة المقطوعة إلى آبار لوحة بئر 12 تحتوي على 1 مل من المتوسط.
ملاحظة: الحرص على تأكيد اتساق سمك وشكل شرائح الأنسجة. المقاطع التي هي أغمق من المتوسط تشير إلى سمك الأنسجة أكبر وتحتاج إلى التخلص منها. شرائح أخف تشير إلى وجود الغراء السيانواكريلات الشفاء وتحتاج إلى التخلص منها. - احتضان شرائح الكبد عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 تحت 95٪ رطوبة.
ملاحظة: استخدمت مجموعات أخرى طرقًا لتعزيز توصيل الأكسجين إلى PCLS ، والتي يبدو أنها تطيل وقت بقاء الأنسجة6،10،11،12،13 (انظر قسم المناقشة). - في اليوم التالي، قم بتغيير متوسط الثقافة باستخدام ماصة يدوية (بدلاً من الشفط) لمنع فقدان الأنسجة من خلال أخطاء الشفط. لاحقاً، تغيير الوسيط على PCLS يومياً. وPCLS جاهزة الآن للاستخدام التجريبي.
5. مثال تطبيق PCLS
- في 16 ساعة ما بعد الجيل, علاج PCLS مع ثلاثة أحماض الصفراوية مختلفة: حمض الجليكوشوليك (GCA), حمض التوروكوليك (TCA), وحمض الكولينيك (CA) (كما أملاح الصوديوم, كل ذلك بتركيز 150 ميكرومتر) لمدة 2 أيام.
- بعد 2 أيام من العلاج حمض الصفراوية، استخراج مرنا عن طريق وضع شرائح الأنسجة في الجليد الباردة الحمض النووي الريبي العازلة وتجانس بسرعة باستخدام الخرز مع المتجانس حبة(جدول المواد).
- تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة العزل الجيش الملكي النيبالي(جدول المواد)وإنشاء cDNA من الحمض النووي الريبي المنقى.
- أداء تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل(جدول المواد)باستخدام أجهزة تمهيدية محددة(الجدول 1)على الحمض النووي لفحص التعبير الجيني.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد صلاحية الخلية من PCLS مع مرور الوقت، تم قياس مستويات ATP الأنسجة. عادة ما تكون مستويات ATP متناسبة مع الجدوى. تمت زراعة PCLS (حوالي 15 مم2 في المنطقة) في وسط William's E العادي مع 10٪ FBS ، ثم في نقاط زمنية محددة ، تمت إزالة شرائح الكبد من زراعة الأنسجة وتجانسها مع كل من تركيزات ATP والبروتين (للتطبيع)(جدول المواد)التي يتم قياسها(الشكل 1A). بالنسبة للاختبارات ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح البروتوكول تطبيق عزل PCLS murine وزراعة الأنسجة ، وتم تصميم الإجراءات لتقييم كل من الجدوى والفائدة وكذلك دراسة آثار الوسطاء الخارجيين لعلم أمراض الباثوبيولوجيا الكبد باستخدام الاختبارات الكيميائية الحيوية ، وعلم الأنسجة ، وqPCR. وقد ثبت فائدة تجريبية من الأنسجة PCLS الاستزراع في القوارض والبشر في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التحقيقات التجريبية في microRNA15/ RNA9/بروتين التعبير16،التمثيل الغذائي17،ديناميات العدو...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (المنحة رقم 100/2000). APP1048740 وAPP1142394 إلى G.A.R. APP1160323 إلى J.E.E.T. ، J.K.O. ، G.A.R.). يتم دعم Grant A. Ramm من قبل زمالة أبحاث كبار من NHMRC في أستراليا (المنحة رقم APP1061332). تم دعم مانويل فرنانديز روخو من قبل برنامج TALENTO في مدريد، إسبانيا (T1-BIO-1854).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طبق بتري 10 سم | GREINER | 664160 | طبق معقم |
| 12 لوحة ثقافة أنسجة جيدة مسطحة القاع | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70٪ محلول الإيثانول (مصنوع من AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | محلول التطهير |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| حمض الكوليك | سيجما ألدريتش | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix ، DuluxGroup (أستراليا) | يجب أن تعمل العلامات التجارية | |
| الأخرى شفرات حلاقة آمنة ذات حافة واحدة يمكن التخلص منها | لوحة تشريح مختلطة | ||
| مصنوعة في المنزل | مادة معقمة على مصل الأبقار الجنينية من البوليسترين | ||
| GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | ||
| ملقط نقطة حادة بطول 130 مم | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 حاضنة | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| هيدرات حمض الجليكوكوليك | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| عزل الثاني RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| كيتامين 50 مل | بروفيت | كيتاي1 | |
| كربس هينسيليت بافر مع جلوكوز مضاف 2000 مجم / لتر | سيجما-ألدريتش | K3753 | يمكن أيضا تصنيعها في المنزل |
| شفاط | هيبا تنقية الهواء | ||
| NanoDrop 2000 / 2000c مقاييس الطيف الضوئي | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin ، Liq 100 مل | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| نصائح الماصة Abt 1000 & micro ؛ ل مرشح | Interpath Interpath | 24800 | |
| نصائح الماصة Abt 10 & micro ؛ ل مرشح Interpath | Interpath | 24300 | |
| نصائح الماصة Abt 200 & micro ؛ ل مرشح | Interpath Interpath | 24700 | |
| أطراف الماصة Abt 20 & micro ؛ ل مرشح Interpath | Interpath 24500 | ||
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| المنقلة | العامة | لقياس زاوية الشفرة | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems / ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | مختلط | ||
| مشرط حامل شفرة | المختلطة | ||
| SensiFAST | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| فرشاة رسم صغيرة بمقبض بلاستيكي | يقاوم الإيثانول | ||
| ذو رأس مربع الرأس | المختلط | ||
| معقم 50 مل أنابيب بلاستيكية | Corning Falcon | 352098 | |
| المشابك الجراحية | المختلطة | ||
| ملقط جراحي | دبابيس | ||
| مقص جراحي | مختلط | ||
| توروكويك | مختلط سيجما-ألدريتش | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 أدوات الدقة العالمية الاهتزازية | الآلية SYS-NVSLM1 | مع التبريد الكهروحراري | |
| لايف تكنولوجيز أستراليا بي تي واي المحدودة | 12551032 | 2.0 جم / لتر جلوكوز | |
| زيلازين 100 مجم / مل 50 مل | بروفيت | XYLAZ4 |
المراجع
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745(2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507(2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73(2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805(2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760(2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582(2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786(2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
