Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لإنتاج شرائح الكبد الدقيقة القابلة للتطبيق من الفئران. يمكن الحفاظ على عينات الأنسجة الجسمية السابقة في ظل ظروف زراعة الأنسجة المختبرية لعدة أيام ، مما يوفر نموذجًا مرنًا لفحص أمراض الباثوبيولوجيا الكبدية.
Abstract
فهم آليات إصابة الكبد، والتليف الكبدي، وتليف الكبد التي تكمن وراء أمراض الكبد المزمنة (أي التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية، وأمراض الكبد الأيضية، وسرطان الكبد) يتطلب التلاعب التجريبي نماذج الحيوانات وثقافات الخلايا المختبرية. كلا الأسلوبين لها قيود ، مثل متطلبات أعداد كبيرة من الحيوانات للتلاعب في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تستنسخ الخلايا المختبرية بنية ووظيفة البيئة الكبدية متعددة الخلايا. استخدام شرائح الكبد بدقة قطع هو تقنية التي يتم الحفاظ على شرائح موحدة من كبد الماوس قابلة للحياة في زراعة الأنسجة المختبرية للتلاعب التجريبي. تحتل هذه التقنية مكانة تجريبية موجودة بين الدراسات الحيوانية وأساليب زراعة الخلايا المختبرية. يصف البروتوكول المقدم طريقة مباشرة وموثوقة لعزل وزراعة شرائح الكبد الدقيقة من الفئران. وتطبيقا لهذه التقنية، يتم التعامل مع شرائح الكبد الجسم الحي السابق مع الأحماض الصفراوية لمحاكاة إصابة الكبد cholestatic وتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية في نهاية المطاف.
Introduction
الإمراض من أمراض الكبد المزمنة معظم (أي التهاب الكبد الفيروسي، والتهاب الكبد غير الكحولية، وإصابة الكبد cholestatic وسرطان الكبد) ينطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع خلايا الكبد المختلفة المتعددة التي تدفع الالتهاب، والتولد الليفي، وتطور السرطان1،2. لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأمراض المزمنة القائمة على الكبد، يجب التحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد المتعددة. في حين أن خطوط الخلايا الكبدية المتعددة (ومؤخرا، organoids) يمكن أن تكون مثقفة في المختبر، وهذه النماذج لا تحاكي بدقة بنية معقدة، وظيفة، والتنوع الخلوي للبيئة الدقيقة الكبدية3. وعلاوة على ذلك، فإن خلايا الكبد المستزرعة (على وجه الخصوص، خطوط الخلايا المتحولة) قد تنحرف عن بيولوجيا مصدرها الأصلي. وتستخدم نماذج الحيوانات تجريبيا للتحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد متعددة. ومع ذلك، قد تصبح منخفضة بشكل كبير في نطاق التلاعب التجريبي، وذلك بسبب آثار كبيرة خارج الهدف في الأعضاء خارج الكبد (على سبيل المثال، عند اختبار العلاجات المحتملة).
استخدام شرائح الكبد الدقيقة القطع (PCLS) في زراعة الأنسجة هو تقنية تجريبية استخدمت لأول مرة في دراسات استقلاب المخدرات وسميتها، وهي تنطوي على قطع شرائح الكبد القابلة للحياة وفائقة النحافة (حوالي 100-250 ميكرومتر) . هذا يسمح التلاعب التجريبي المباشر من أنسجة الكبد السابقين الجسم الحي4. هذه التقنية الجسور الفجوة التجريبية بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وطرق زراعة الخلايا في المختبر ، والتغلب على العديد من العيوب من كلا الطريقتين (أي ، حدود عملية على مجموعة من التجارب التي يمكن القيام بها في الحيوانات كلها ، فضلا عن فقدان الهيكل / وظيفة والتنوع الخلوي مع أساليب زراعة الخلية المختبرية).
وعلاوة على ذلك، يزيد PCLS بشكل كبير من القدرة التجريبية مقارنة بالدراسات الحيوانية الكاملة. كما يمكن أن تنتج ماوس واحد أكثر من 48 شرائح الكبد، وهذا يسهل أيضا استخدام كل من مجموعات التحكم والعلاج من نفس الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه التقنية فعليًا أنسجة الكبد عن أنظمة الأعضاء الأخرى . لذلك ، فإنه يزيل الآثار المحتملة خارج الهدف التي يمكن أن تحدث في الحيوانات بأكملها عند اختبار آثار المحفزات الخارجية.
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء PCLS باستخدام هزاز مع شفرة تهتز بشكل طولاني. وقد استخدمت دراسات أخرى بنجاح تقطيع الأنسجة Krumdieck، كما هو موضح في أولينغا وشوبان5. في الهزاز ، يمنع الاهتزاز الجانبي للشفرة تمزق الأنسجة فائقة النحافة الناجمة عن إجهاد القص ، حيث يتم دفع النصل إلى الأنسجة. يعمل كل من الهزاز وتقطيع الأنسجة Krumdieck بشكل فعال دون التضمين الهيكلي لأنسجة الكبد ، مما يبسط إجراء التقطيع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لإنشاء PCLS من الكبد المريضة، بما في ذلك تلك من نماذج الماوس من التليف / تليف الكبد6 والتهاب الكبد7.
بالإضافة إلى إظهار التقنيات اللازمة لإعداد وزراعة الأنسجة من PCLS، وهذا التقرير يدرس أيضا صلاحية هذه الأنسجة الجسم الحي السابقين عن طريق قياس مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وفحص أنسجة الأنسجة لتقييم نخر والتليف. كإجراء تجريبي تمثيلي ، يتم التعامل مع PCLS بتركيزات فيزيولوجية ثلاثية من ثلاثة أحماض صفراء مختلفة (glycocholic ، taurocholic ، والأحماض التشوليك) لمحاكاة إصابة الكبد الالمرارة. في سياق إصابة الكبد التشوستاتيكي ، ثبت أن حمض الطوروكوليك على وجه الخصوص قد زاد بشكل كبير في كل من المصل والصفراء للأطفال الذين يعانون من التليف الكيسي المرتبط بمرض الكبد8.
كما تم علاج خلايا ذرية الكبد في المختبر مع حمض التاوروشوليك لمحاكاة مستويات حمض التاوروشوليك المرتفعة التي لوحظت في المرضى ، وتسبب هذا العلاج في زيادة انتشار وتمايز خلايا ذرية الكبد نحو نمط فينوتاي (cholangiocyte) الصفراري (cholangiocyte)9. وفي وقت لاحق، عولجت الـ PCLS بالجسم الحي السابق بمستويات مرتفعة من حمض الطوروكوليتش، ولوحظت علامات الكولينجيوسيتي المتزايدة. وهذا يدعم الملاحظة المختبرية أن حمض الطوروتشوليك يدفع الانتشار الصفراري و / أو التمايز في سياق مرض الكبد المرتبط بالتليف الكيسي للأطفال9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمدونة الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها للأغراض العلمية في معهد البحوث الطبية QIMR Berghofer بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات في المعهد. تم الحصول على ذكور فئران C57BL/6 (15-20 أسبوعاً) من مركز الموارد الحيوانية، غرب أستراليا.
ملاحظة: يجب تعقيم جميع الحلول والوسائط والأدوات والأجهزة والأنابيب التي تتصل بالعينات أو تطهيرها تمامًا باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 70٪ والتعامل معها باستخدام تقنيات معقمة لتقليل خطر تلوث الثقافة.
1. إعداد الهزاز
- إعداد محلول العازلة كريبس-Henseleit المعقم مع 2 غرام / لتر الجلوكوز(جدول المواد). تأكد من أن درجة الحموضة للمخزن المؤقت هو 7.4. إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى, تشبع المخزن المؤقت مع carbogen (95% O2 + 5% CO2)أو احتضان داخل 5% CO2 حاضنة زراعة الأنسجة لتصحيح نظام التخزين المؤقت بيكربونات. قم بتبريد المحلول العازل المعقم المختوم عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- أدخل شفرة الهزاز في ذراع القطع. تأكد من أن النصل ثابت بإحكام على ذراع القطع ، حيث يمكن أن تتسبب الاهتزازات في أن يكون النصل فضفاضًا.
- تطهير شفرة وقطع الذراع مع محلول الإيثانول 70٪.
تنبيه: تجنب ملامسة النصل. - تطهير علبة عازلة مع محلول الإيثانول 70٪ ومسحه بأنسجة معقمة.
- أدخل علبة المخزن المؤقت في الهزاز وتشديد آلية التركيب.
- تعيين ذراع القطع إلى أقصى ارتفاع متاح.
- تعيين زاوية شفرة إلى 10 درجة تحت الأفقي، المنحدرة إلى أسفل إلى العينة. تأكد من أن زاوية النصل ثابتة بإحكام.
ملاحظة: قد تختلف زاوية النصل المثلى اعتمادًا على نموذج الهزاز وخصائص الأنسجة. - تطهير حامل العينة مع محلول الإيثانول 70٪.
- قم بتوصيل مياه التبريد لمبرد بلتييه الحراري الموجود تحت الدرج العازل.
ملاحظة: تستخدم بعض نماذج الهزاز حمام ثلج للتبريد بدلاً من ذلك. - إصلاح أنبوب المياه التدريجي إلى استنزاف وتحويل المياه. تعيين برودة إلى 4 درجة مئوية. تشغيل مياه التبريد بمعدل أكثر من 400 مل / دقيقة.
- ملء علبة عازلة تقريبا إلى الأعلى مع الثلج الباردة المعقمة كريبس-Henseleit العازلة (مع 2 غرام / لتر الجلوكوز). ترك إضافية كريبس-Henseleit حل عازلة على الجليد.
2. إزالة الكبد وإعداد
- تعقيم أو تطهير جميع الأدوات الجراحية بما في ذلك ملقط المنحني، ملقط مربع ة مسطحة، ملاقط، المشابك الجراحية، ومقص باستخدام الأوتوكلاف.
- قبل إزالة الكبد، وحقن الفئران بعمق باستخدام حقن داخل البلغ100 ملغ/كغ الكيتامين و 12.5 ملغ/كغ xylazine.
ملاحظة: يمكن استخدام مخدر آخر، أو يمكن أن تكون الفئران القتل الرحيم عن طريقثاني أكسيد الكربون الاختناق / خلع عنق الرحم إذا تمت إزالة الكبد بسرعة لمنع الضرر الناجم عن نقص الأكسجة. - تطهير أسطح الجلد على الفئران عن طريق التبول مع محلول الإيثانول 70٪. الفئران آمنة على ظهورهم مع جميع الأطراف المثبتة على لوحة تشريح.
- جعل شق خط الوسط العمودي في الجلد من قاعدة تجويف البطن إلى أعلى الحجاب الحاجز.
ملاحظة: يتم إجراء شقوق نحو الأطراف لتسهيل التراجع عن الجلد. - سحب الجلد مرة أخرى في حين قطع أي النسيج الضام بين الجلد وتجويف البطن. منع نقل الشعر إلى تجويف البطن قدر الإمكان. دبوس أو المشبك الجلد بعيدا عن تجويف البطن.
- باستخدام ملقط نظيفة ومقص، وفتح تجويف البطن وانخفاض تجويف الصدر.
- إزالة الكبد بسرعة دون الإضرار الفصوص
- باستخدام أدوات حادة (على سبيل المثال، ملقط مربع الحافة المسطحة)، دليل الفصوص الكبد العلوي إلى أسفل نحو البطن. قطع النسيج الضام المحيطة فصوص الكبد العلوي باستخدام مقص.
- توجيه فصوص الكبد صعودا نحو الحجاب الحاجز. عقد حزمة الأوعية الدموية المركزية من الكبد مع ملقط.
ملاحظة: لن يؤثر على الإجراء إذا تضررت حزمة الأوعية الدموية المركزية. - سحب حزمة الأوعية الدموية المركزية بعيدا عن الماوس وقطع النسيج الضام المتبقية، والأوعية الدموية، وما إلى ذلك لإزالة الكبد. الحرص على عدم 1) تلف فصوص الكبد و 2) قطع في الجهاز الهضمي، وهذا قد تلوث الكبد مع الكائنات الحية الدقيقة.
- ضع الكبد الذي تمت إزالته في طبق تعقيمي لاستزراع الأنسجة بطول 10 سم نصف مملوء بمحلول العازلة كريبس-هينسلِت البارد. باستخدام أداة حادة لتوجيه الفصوص، وقطع مركز الكبد لتقسيمه إلى فصوص منفصلة.
- حدد فص كبد واحد (استخدم الجزء الأكبر أولاً)، وضعه مسطحاً إلى أسفل على طبق جديد معقم بطول 10 سم. الحفاظ على جميع فصوص الكبد الأخرى في طبق من محلول العازلة كريبس-Henseleit المخزنة على الجليد للاستخدام اللاحق.
- تقليم حوالي 10٪ من المواد من أطول حافة من فص الكبد في حين الكذب شقة.
ملاحظة: التشذيب مهم، لأن حافة الأنسجة هذه ستتصل بشفرة القطع أولاً؛ لذلك ، فإن حافة الأنسجة التي هي عمودي نسبيًا على شفرة القطع ستمنع ضغط الأنسجة الذي يمكن أن يحدث بسبب الزوايا الضحلة في فصوص الكبد غير المصقولة. - تقليم حواف الأنسجة الثلاثة الأخرى.
ملاحظة: هذا يزيل بعض كبسولة غليسون الليفية وسيجعل فصل شرائح الأنسجة أسهل. - تركيب فص الكبد على حامل العينة
- ضع طبقة رقيقة من الغراء السيانواكريلات (الغراء الفائق أو الغراء الطبي / البيطري الصف سيانواكريلات) على حامل العينة نحو الجبهة، وحجم أكبر قليلا من فص الكبد قلصت.
ملاحظة: تأكد من أن الغراء السيانواكريلات لا يحتوي على إضافات غير سيانواكريلات. - التقط فص الكبد برفق مع ملقط معقم باستخدام زاوية بعيدًا عن حافة القطع ، ثم قم بتجفيف أي عازلة متبقية من الجانب المسطح من فص الكبد باستخدام مواد ماصة معقمة.
- ضع الجانب المسطح الكبير من فص الكبد على رقعة الغراء السيانواكريلات مع أكبر حافة تواجه نحو الأمام. السماح لها لعلاج في الهواء لمدة 1-2 دقيقة.
ملاحظة: المواد اللاصقة السيانواكريلات علاج بسرعة (~ 2 دقيقة) استجابة لبروتينات الرطوبة والأنسجة المتبقية، وأنها سوف نعلق بحزم الأنسجة إلى حامل العينة.
- ضع طبقة رقيقة من الغراء السيانواكريلات (الغراء الفائق أو الغراء الطبي / البيطري الصف سيانواكريلات) على حامل العينة نحو الجبهة، وحجم أكبر قليلا من فص الكبد قلصت.
3. إنتاج شرائح الكبد
- ضع حامل العينة مع فص الكبد المرفق في صينية العازلة الهزاز. تأكد من تغطية فص الكبد بالكامل بواسطة المخزن المؤقت.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، ارفع مستوى محلول العازلة كريبس-هينسيليت الباردة. إذا كان مستوى المخزن المؤقت يحجب عملية القطع، قم بزيادة المستوى أو إنقاصه. - ضبط سرعة القطع.
ملاحظة: قد يحتاج هذا إلى تحديد تجريبي احسب نموذج الهزاز وخصائص النصل. كدليل بدء، استخدم سرعة 57 هرتز/3,420 دورة في الدقيقة. يمكن قياس سرعة الهزاز باستخدام تطبيق محلل الطيف الصوتي على الهاتف الذكي. - خفض شفرة القطع حتى يقع فقط فوق فص الكبد باستخدام ارتفاع الطلب. تشغيل ذراع القطع تهتز على العينة.
- عودة شفرة مرة أخرى باستخدام مقبض كرنك في الاتجاه المعاكس. تنشيط الاهتزازات أثناء إرجاع النصل. بعد أن عاد النصل وليس فوق العينة، خفض ارتفاع شفرة من قبل 250 ميكرون.
- كرر عملية القطع حتى تتم إزالة الجزء العلوي من الأنسجة. تجاهل أول شريحة أو شريحتين ، لأن هذه ستحتوي على كبسولة غليسون وبالتالي لا تحتوي على الكثير من أنسجة الكبد الوظيفية مقارنة بشرائح أخرى.
- لقطع شرائح الكبد، تقدم ببطء شفرة تهتز في الأنسجة عن طريق تحويل مقبض. استخدام فرشاة الطلاء الصغيرة (تطهيرها مع محلول الإيثانول 70٪) لتوجيه بلطف الأنسجة أثناء عملية القطع.
- استخدام فرشاة الطلاء لرفع شرائح الأنسجة قطع ووضع شريحة الأنسجة في أنبوب معقم من الجليد الباردة كريبس-Henseleit العازلة. عندما لا تكون في الاستخدام، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد بين شرائح.
ملاحظة: في بعض الأحيان، الأنسجة لا المسيل للدموع أثناء عملية القطع، ولكن بالنسبة لمعظم الأغراض الأنسجة لا تزال صالحة للاستخدام. - كرر عملية القطع حتى يتم الوصول إلى قاعدة فص الكبد. تجاهل أي شرائح الكبد التي لديها الغراء الشفاء مرئية.
ملاحظة: الغراء الشفاء مرئية كمناطق بيضاء على شرائح الأنسجة. سوف يكون الفص الكبد نموذجي فقط سمك صالحة للاستعمال من حوالي 2 ملم. لذلك ، يتم إنتاج حوالي ثماني شرائح كبد 250 ميكرومتر فقط من كل فص. - قطع شرائح الأنسجة حتى بالقرب من الغراء سيانواكريلات. لا تقطع في الغراء.
- كرر العملية برمتها مع فصوص الكبد الأخرى حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من شرائح الأنسجة.
- لتنظيف الغراء السيانواكريلات الشفاء والأنسجة من حامل العينة، إما استخدام شفرة لكشط الغراء الشفاء / خليط الأنسجة قبالة، أو تليين وتنظيف الخليط مع الأسيتون أو ثنائي ميثيل sulfoxide.
4- زراعة الأنسجة
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع أعمال زراعة الأنسجة في غطاء تدفق لامير العقيمة.
- في غطاء تدفق اللاصفي ثقافة الأنسجة, ماصة 1 مل من المتوسطة E وليام التي تحتوي على 2.0 غرام / لتر الجلوكوز, 10% مصل الأبقار الجنين (FBS), 2 mM L-غلوتامين الملحق, 100 U/mL البنسلين, و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوموسين في 12 لوحات زراعة أنسجة الآبار.
ملاحظة: يمكن أيضًا إضافة مضادات حيوية أخرى وعوامل مضادة للفطريات. وقد استخدمت بعض الدراسات إضافات في وسط حضانة الأنسجة (أي ديكساميثازون والأنسولين10)، ولكن هذه يمكن أن تتداخل مع إشارات الخلية. - ضع الأنبوب الذي يحتوي على شرائح كبد من الثلج في غطاء زراعة الأنسجة. لإزالة شرائح الأنسجة، دوامة بلطف الخليط وتلميح بلطف في طبق معقم 10 سم في حين يحوم.
- باستخدام ملقط حادة النقطة معقمة ومشرط، وقطع شرائح الأنسجة إلى أحجام موحدة تقريبا (على سبيل المثال، 15 ملم2).
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لضمان مساحة سطح متناسقة. لأن فصوص كبد الماوس تختلف اختلافا كبيرا في الحجم وبعض شرائح الأنسجة سوف المسيل للدموع، وهذا سوف تنتج مجموعة من PCLS مع مناطق سطحية مختلفة. تعتمد أحجام المساحة السطحية النهائية لـ PCLS على كمية المواد المطلوبة في تطبيقات التحليل اللاحقة وعدد مرات التكرار المطلوبة. قطع PCLS كبيرة إلى قطع متعددة أصغر من نفس الحجم التقريبي سوف تسمح بالفطرة عدد متزايد من يكرر التجريبية. - باستخدام ملقط معقم أو فرشاة طلاء صغيرة، نقل شرائح الأنسجة المقطوعة إلى آبار لوحة بئر 12 تحتوي على 1 مل من المتوسط.
ملاحظة: الحرص على تأكيد اتساق سمك وشكل شرائح الأنسجة. المقاطع التي هي أغمق من المتوسط تشير إلى سمك الأنسجة أكبر وتحتاج إلى التخلص منها. شرائح أخف تشير إلى وجود الغراء السيانواكريلات الشفاء وتحتاج إلى التخلص منها. - احتضان شرائح الكبد عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 تحت 95٪ رطوبة.
ملاحظة: استخدمت مجموعات أخرى طرقًا لتعزيز توصيل الأكسجين إلى PCLS ، والتي يبدو أنها تطيل وقت بقاء الأنسجة6،10،11،12،13 (انظر قسم المناقشة). - في اليوم التالي، قم بتغيير متوسط الثقافة باستخدام ماصة يدوية (بدلاً من الشفط) لمنع فقدان الأنسجة من خلال أخطاء الشفط. لاحقاً، تغيير الوسيط على PCLS يومياً. وPCLS جاهزة الآن للاستخدام التجريبي.
5. مثال تطبيق PCLS
- في 16 ساعة ما بعد الجيل, علاج PCLS مع ثلاثة أحماض الصفراوية مختلفة: حمض الجليكوشوليك (GCA), حمض التوروكوليك (TCA), وحمض الكولينيك (CA) (كما أملاح الصوديوم, كل ذلك بتركيز 150 ميكرومتر) لمدة 2 أيام.
- بعد 2 أيام من العلاج حمض الصفراوية، استخراج مرنا عن طريق وضع شرائح الأنسجة في الجليد الباردة الحمض النووي الريبي العازلة وتجانس بسرعة باستخدام الخرز مع المتجانس حبة(جدول المواد).
- تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة العزل الجيش الملكي النيبالي(جدول المواد)وإنشاء cDNA من الحمض النووي الريبي المنقى.
- أداء تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل(جدول المواد)باستخدام أجهزة تمهيدية محددة(الجدول 1)على الحمض النووي لفحص التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد صلاحية الخلية من PCLS مع مرور الوقت، تم قياس مستويات ATP الأنسجة. عادة ما تكون مستويات ATP متناسبة مع الجدوى. تمت زراعة PCLS (حوالي 15 مم2 في المنطقة) في وسط William's E العادي مع 10٪ FBS ، ثم في نقاط زمنية محددة ، تمت إزالة شرائح الكبد من زراعة الأنسجة وتجانسها مع كل من تركيزات ATP والبروتين (للتطبيع)(جدول المواد)التي يتم قياسها(الشكل 1A). بالنسبة للاختبارات الكيميائية الحيوية مثل هذه ، فإن التطبيع مهم ، حيث أن شرائح الكبد المقطوعة ليست بالضرورة متطابقة في الأبعاد. تم قمع مستويات ATP (نسبة إلى البروتين) مباشرة بعد العزلة وبعد 1 ساعة(الشكل 1A)، مما يشير إلى الإجهاد الأيضي على المدى القصير من إجراءات التبريد والقطع. ومع ذلك، ظلت مستويات ATP المستردة بمقدار 3 ساعة، حيث ظلت مستويات ATP مرتفعة في فترة تصل إلى 5 أيام من زراعة الأنسجة، مما يشير إلى عدم حدوث انخفاض كبير في قابلية البقاء. تشير تلطيخ شرائح الكبد من الهيماتوكسيلين والأوسين (H&E) إلى أن نخر الأنسجة المحدود (الذي يتميز بالورم النووي) حدث في الثقافة من حوالي اليومين 2 و3. مستويات نخر الأنسجة تقدمت إلى شديدة بحلول اليوم 5(الشكل 1B). وبالنظر إلى هذه البيانات المورفولوجية، التي تؤخذ جنبا إلى جنب مع نتائج ATP، فمن المستحسن استخدام هذا النموذج الأنسجة التجريبية لمدة تصل إلى 3 أيام.
كما عرض PCLS تراكم الكولاجين المتزايد في وقت لاحق من الثقافات، كما هو مبين من خلال سماكة ألياف الكولاجين الملطخة بالأحمر Picro-sirius في اليوم 5(الشكل 2). هذا سماكة ألياف الكولاجين تشير إلى أن العمليات الليفية التلقائية نشطة في PCLS التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة. هذه العملية تبدو مستقلة عن منهجية عزل PCLS مع سماكة ألياف الكولاجين6 والتعبير الجيني profibrogenic14 التي تحدث من كل من الهزاز وكرومديك شرائح الأنسجة، على التوالي، مع مرور الوقت. تطوير هذه العمليات الليفية التلقائية يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير علم الأحياء PCLS، لا سيما مع التجارب المرتبطة العمليات الليفية.
لقد أظهرنا سابقا تحريض كبير من كوناكسين جين cholangiocyte محددة 43(Cx43)وإفراز الجلوتاميل transpeptidase(Ggt1)البروتين من قبل TCA في PCLS9. التعبير عن الجينات الكولينجيوسيتية الخاصة بالنسبة لضوابط التدبير المنزلي (الجلسرالدهيد 3-الفوسفات dehydrogenase[Gapdh]وهوكزانثين الفوسفوريفوسيل ترانسفياس 1[Hprt1])في PCLS تعامل مع TCA، GCA، أو CA تم فحصها من قبل qPCR باستخدام التمهيديات محددة. تمشيا مع تقرير سابق, تحريض كبير في التعبير عن الجينات الكولينجيوسيتية محددة cytokeratin 19(CK19; الشكل 3A)وconnexin 43(Cx43; وقدلوحظ الشكل 3باءمن قبل كل من GCA وTCA. تم زيادة التعبير Ggt1 من قبل كل من الأحماض الصفراوية; على الرغم من أن هذا لم يصل إلى الأهمية الإحصائية ، وربما يرجع ذلك إلى الاختلاف التجريبي(الشكل 3C). لم يتأثر تعبير CA بأي حمض الصفراء. تحريض الجينات المحددة cholangiocyte يشير إلى أن GCA قد تشارك أيضا في إصابة الكبد cholestatic, كما ذكرت سابقا لTCA8,9.
الشكل 1: صلاحية الأنسجة لشرائح الكبد الدقيقة القطع (PCLS). (أ)تم قياس مستويات ATP والبروتين في PCLS على الفور (T + 0) وفي 1 ساعة و 3 ساعة و 6 ساعة و 1-5 أيام بعد العزلة. (ب)لفحص مورفولوجيا الخلايا، تم إصلاح PCLS، البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطعة، وملطخة H & E على الفور (اليوم 0) وفي 1، 2، و 5 أيام بعد العزلة. تم إجراء اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار مقارنات متعددة لـ Dunn نسبة إلى T + 0. يتم تمثيل جميع البيانات كمتوسط ± SEM (n = 2−3 فئران) مع *p < 0.05. تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقييم ترسب الكولاجين في PCLS. تم إصلاح PCLS ، البارافين جزءا لا يتجزأ ، مقطعة ، وملطخة بالأحمر Picro-Sirius لتصور ألياف الكولاجين في أيام 0 و 1 و 2 و 5 بعد العزلة. تمثل أشرطة المقياس 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الأحماض الصفراوية تحفز التعبير الجيني الخاص بالكولينجيوسيتي. في 16 ساعة بعد العزلة، تم تغيير المتوسطة على PCLS، وأضيف وسيط جديد جنبا إلى جنب مع 150 ميكرومتر غليكوليتش (GCA)، taurocholic (TCA)، أو الكولينيتش (CA) الأحماض (أملاح الصوديوم). تم حصاد PCLS بعد 2 أيام، والتعبير عن سيتوكيراتين 19(CK19؛ A)،connexin 43 (Cx43; ب)، وg-الجلوتاميل transpeptidase 1(Ggt1؛ ج) تم فحصها نسبة إلى المتوسط الهندسي لغابد وHprt1. تم إجراء اختبار مقارنات متعددة من دونيت نسبة إلى شرائح أنسجة التحكم غير المعالجة (n = 15). يتم تمثيل جميع البيانات كمتوسط ± SEM (n = 4 فئران ، شرائح ثلاثية ؛ * p < 0.05 ، ** p < 0.01). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الكبيات qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوضح البروتوكول تطبيق عزل PCLS murine وزراعة الأنسجة ، وتم تصميم الإجراءات لتقييم كل من الجدوى والفائدة وكذلك دراسة آثار الوسطاء الخارجيين لعلم أمراض الباثوبيولوجيا الكبد باستخدام الاختبارات الكيميائية الحيوية ، وعلم الأنسجة ، وqPCR. وقد ثبت فائدة تجريبية من الأنسجة PCLS الاستزراع في القوارض والبشر في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك التحقيقات التجريبية في microRNA15/ RNA9/بروتين التعبير16،التمثيل الغذائي17،ديناميات العدوى الفيروسية10،,18،عدوى تشير19،غزو الورم12،دراسات سمية4،,13،,15،,20،تلف الحمض النووي دراسات21، بيولوجيا الخلية14، وإفراز الدراسات9.
في حين أن مستويات ATP تشير إلى قابلية صلاحية الخلية في PCLS تصل إلى 5 أيام في الثقافة ، تشير تلطيخ H & E إلى أن النخر الشديد كان يحدث بحلول 5 أيام في الثقافة. العامل الرئيسي الذي يبدو للحد من صلاحية PCLS هو توافر الأكسجين6،11. وقد شملت العديد من الدراسات تعزيز توافر الأكسجين وبالتالي زيادة وقت صلاحية PCLS في زراعة الأنسجة. وتشمل الطرق المستخدمة لزيادة توافر الأكسجين حضانة الأنسجة في الأجواء الغنية بالأكسجين10،11، استخدام الناقل الأكسجين perfluorodecalin12، اهتزاز / المتداول الثقافة خلال حضانة6،10،13، ولوحات زراعة الأنسجة المصممة لتحقيق أقصى قدر من الأوكسجين6.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف نظام مبتكر لاستزراع الأنسجة البينية بين الهواء والسائل مع فائدة وظيفية مذكورة في فترة أطول من 7 أيام في الثقافة14. يستخدم هذا البروتوكول الأكسجين المحيط في الغلاف الجوي في حاضنة زراعة الأنسجة العادية. تسمح هذه الطريقة PCLS لتكون في متناول المختبرات التي ليس لديها معدات متخصصة للغاية، ومخصصة لتعزيز تسليم الأكسجين بأمان. ومع ذلك، إذا كانت هذه الأساليب لتعزيز توصيل الأكسجين متوفرة، فإنها قد تحسن من قدرة PCLS على المدى الطويل في الثقافة.
تراكم الكولاجين في PCLS بعد اليوم 3 في الثقافة تشير إلى أن العمليات الليفية التلقائية نشطة داخل هذا النموذج. كما لوحظ التليف التلقائي سابقا في PCLS6،14،22،23،24 وربما يتوسطها الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) الصادرة عن عملية القطع أو نخر الأنسجة. تعمل DAMPs كجزيئات إشارة تقوم فيما بعد بتنشيط مسارات الإشارات المؤيدة للليفية25و26. وعلاوة على ذلك، يمكن التوسط التليف التلقائي في PCLS من قبل chemokines صدر من تفعيل الخلايا ستيلاتي و / أو خلايا كوبفر (أي تحويل عامل النمو بيتا [TGF-α]). في هذا السياق، مقال صدر مؤخرا من قبل Bigaeva وآخرون24 يشير إلى أن التليف التلقائي في PCLS هو في جزء من بوساطة TGF-α الإشارات، واحتضان PCLS مع مثبط TGF-α Galunisertib تثبيط التغيرات التعبير الجيني المرتبطة التليف الكبدي التلقائي. وثمة آلية أخرى ممكنة هي أن إجراء التقطيع يؤدي في البداية إلى مسارات إشارات انتشار الخلايا ودخول خلايا الكبد إلى دورة الخلية؛ ومع ذلك ، تفشل هذه الآلية وتسفر عن اعتقال دورة الخلية في المرحلة27G1. ويرتبط اعتقال دورة الخلية مع التليف الكبدي بدلا من التجدد الكبدي28.
في الإجراء التجريبي التمثيلي ، يتم علاج PCLS بثلاثة أحماض صفراء مختلفة (GCA ، TCA ، و CA) لمدة يومين لمحاكاة إصابة الكبد المليئة بالمرارة. اثنين من الأحماض الصفراوية (GCA وTCA) حث تعبير كبير من CK19 وCx43، والتي هي الجينات المرتبطة وظيفة cholangiocyte. وهذا يشير إلى توسيع أو تمايز الخلايا نحو سلالة cholangiocyte في PCLS تعامل مع هذه الأحماض الصفراوية. وهذا يتسق مع عملنا السابق الذي يظهر تأثيرًا مماثلًا باستخدام TCA9 على PCLS. وعلاوة على ذلك، فإنه يتسق أيضا مع الملاحظات في الجسم الحي التي تظهر تغذية توروخولات للفئران يزيد من أرقام cholangiocyte29. علاج شرائح أنسجة الكبد مع الأحماض الصفراوية يحاكي الكولستيستاسيس الكبدي، وتكهن بأن الزيادة في التعبير عن الجينات المرتبطة وظيفة cholangiocyte هو محاولة من قبل أنسجة الكبد لخلق قنوات الصفراوية إضافية لزيادة إفراز الصفراء. وبالنظر إلى تحريض محدد من هذه الجينات يتم إنتاجها من قبل الأحماض الصفراوية مترافق (GCA وTCA) ولكن ليس CA غير المناوج، ويشتبه في أن هذه الآثار تتوسط هاس-1-الفوسفات مستقبلات 2، مستقبلات سطح الخلية مع التنشيط التفضيلية من قبل الأحماض الصفراويةمترافق300.
أحد القيود الرئيسية لتطبيق PCLS هو التباين النسخ المتماثل الفردي. منذ الكبد ليست متجانسة وهناك تباين في الإنتاج، شرائح الكبد تميل إلى أن يكون الاختلاف البيولوجي أكبر من التجارب ثقافة الخلية. في الدراسات التجريبية مع متغيرات قليلة، مثل الإجراء التمثيلي المبين أعلاه، يتم التغلب على هذا باستخدام عدد متزايد من اليكررات. ومع ذلك، قد يصبح هذا مشكلة لدراسات الفحص الأكبر. وخلاصة القول، فإن البروتوكول الموصوف هو طريقة مباشرة وموثوق بها لدراسة جوانب أمراض المسالك الكبدية السابقين، والتي تتطلب القليل من المعدات المتخصصة باستثناء الهزاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (المنحة رقم 100/2000). APP1048740 وAPP1142394 إلى G.A.R. APP1160323 إلى J.E.E.T. ، J.K.O. ، G.A.R.). يتم دعم Grant A. Ramm من قبل زمالة أبحاث كبار من NHMRC في أستراليا (المنحة رقم APP1061332). تم دعم مانويل فرنانديز روخو من قبل برنامج TALENTO في مدريد، إسبانيا (T1-BIO-1854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri Dish | GREINER | 664160 | Sterile Dish |
| 12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom | Greiner Bio-one | 665180 | |
| 70% Ethanol Solution (made with AR Grade) | Chem-Supply Pty Ltd | EA043-20L-P | Disinfection solution |
| Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | AA008-2.5L | |
| Cholic acid | Sigma-Aldrich | C1129-100G | |
| Cyanoacrylate Super Glue | Parfix, DuluxGroup (Australia) | Other brands should work | |
| Disposable Single Edge Safety Razor Blades | Mixed | ||
| Dissection Board | Made in-house | Sterile material over polystyrene | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.02 | |
| Forceps sharp point 130 mm long | ThermoFisher Scientific | MET2115-130 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 371 | |
| Glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 25030081 | |
| Glycocholic acid hydrate | Sigma-Aldrich | G2878-100G | |
| ISOLATE II RNA Mini Kit | Bioline (Aust) Pty Ltd | BIO-52073 | |
| Ketamine 50 ml | Provet | KETAI1 | |
| Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L | Sigma-Aldrich | K3753 | Can also be made in house |
| Laminar Flow Hood | Hepa air filtration | ||
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140-122 | |
| Picro Sirius Red | ABCAM Australia Pty Ltd | ab246832 | |
| Pipette Tips Abt 1000 µl Filter Interpath | Interpath | 24800 | |
| Pipette Tips Abt 10 µl Filter Interpath | Interpath | 24300 | |
| Pipette Tips Abt 200 µl Filter Interpath | Interpath | 24700 | |
| Pipette Tips Abt 20 µl Filter Interpath | Interpath | 24500 | |
| Precellys Homogeniser | Bertin Instruments | P000669-PR240-A | |
| Protractor | Generic | To measure blade angle | |
| Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block | Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific | ||
| Scalpel Blade | Mixed | ||
| Scalpel Blade Holder | Mixed | ||
| SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline (Aust) PTY LTD | ||
| Small Paintbrush with Plastic Handle | Mixed | Plastic handle resists ethanol | |
| Square-Head Foreceps | Mixed | ||
| Sterile 50 ml Plastic Tubes | Corning Falcon | 352098 | |
| Surgical Clamps | Mixed | ||
| Surgical Forceps | Mixed | ||
| Surgical Pins | Mixed | ||
| Surgical Scissors | Mixed | ||
| Taurochoic acid | Sigma-Aldrich | T-4009-5G | |
| Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice | World Precision Instruments | SYS-NVSLM1 | With thermoelectric cooling |
| Williams Medium E | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12551032 | 2.0 g/l glucose |
| Xylazine 100 mg/mL 50 mL | Provet | XYLAZ4 |
References
- Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).
- Ouchi, R., et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).
- Vickers, A. E., Fisher, R. L. Organ slices for the evaluation of human drug toxicity. Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).
- Olinga, P., Schuppan, D. Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo. Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).
- Paish, H. L., et al. A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
- Prins, G. H., et al. A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices. Nutrients. 11 (3), 507 (2019).
- Ramm, G. A., et al. Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment. Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).
- Pozniak, K. N., et al. Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease. The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).
- Clouzeau-Girard, H., et al. Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices. Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).
- Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Granitzny, A., et al. Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound. Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).
- Wu, X., et al. Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform. Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).
- Zarybnicky, T., et al. Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).
- van de Bovenkamp, M., et al. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).
- Buettner, R., et al. Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system. Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).
- Lagaye, S., et al. Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model. World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).
- Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).
- Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro. Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).
- Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro. Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).
- Guyot, C., et al. Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices. Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).
- Bigaeva, E., et al. Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices. Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).
- Kiziltas, S. Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases. World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).
- Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases. Gut. 58 (5), 704-720 (2009).
- Finot, F., et al. Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices. International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).
- Marshall, A., et al. Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).
- Alpini, G., et al. Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes. Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).
- Studer, E., et al. Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes. Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).
