Генерация рекомбинантных ротавирусов из плазмидной ДНК является важным инструментом для изучения ротавирусной репликации и патогенеза, а также развития переносчиков и вакцин с использованием ротавирусного экспрессии. В этом мы описываем упрощенный обратный подход к генетике для генерации рекомбинантных ротавирусов, включая штаммы, выражающие флуоресцентные белки репортера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Упрощенный обратный метод генетики для восстановления рекомбинантных ротавирусов Экспрессинг Репортер белки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ротавирусы представляют собой большую и развивающуюся популяцию сегментированных двухцепочечных РНК-вирусов, вызывающих тяжелый гастроэнтерит у молодых многих видов млекопитающих и птиц, включая людей. С недавним появлением ротавирусной системы обратной генетики стало возможным использовать направленный мутагенез для изучения ротавирусной биологии, модификации и оптимизации существующих ротавирусных вакцин и разработки переносчиков ротавирусной многоцелевой вакцины. В этом отчете мы описываем упрощенную систему обратной генетики, которая позволяет эффективно и надежно восстановить рекомбинантные ротавирусы. Система основана на сотрансфокации векторов транскрипции T7, выражающих полноформатный ротавирус (КВ) РНК и вектор CMV, кодирующий фермент РНК в клетки BHK, образующие т7 РНК-полимеразы (BHK-T7). Рекомбинантные ротавирусы усиливаются, контролируя трансинфицированные клетки BHK-T7 с ma104 клетками, линией клеток почек обезьяны, которая является весьма вседозволенной для роста вируса. В этом отчете мы также описываем подход к генерации рекомбинантных ротавирусов, которые выражают отдельный флуоресцентный белок репортера путем введения 2A переводного элемента стоп-перезагрузки в сегмент генома 7 (NSP3). Такой подход позволяет избежать удаляния или модификации любого из вирусных открытых кадров для чтения, что позволяет выпускать рекомбинантные ротавирусы, которые сохраняют полностью функциональные вирусные белки, выражая флуоресцентный белок.
Введение
Ротавирусы являются основными причинами тяжелого гастроэнтерита у младенцев и маленьких детей, а также молодых многих других млекопитающих и птиц видов1. Как члены семейства Reoviridae, ротавирусы имеют сегментированный двухцепочечный геном РНК (dsRNA). Сегменты генома содержатся в неописуемом икосахедря, образованном из трех концентрических слоев белка2. На основе секвенирования и филогенетического анализа сегментов генома было определено девять видов ротавируса (A'D, F-J)3. Эти штаммы, включающие ротавирусного вида А, ответственны за подавляющее большинство болезней человека
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка средств массовой информации и поддержание культуры клеток
- Получить ребенка хомяка почек клетки, составляющие выражая T7 РНК полимеразы (BHK-T7) и африканской зеленой обезьяны почки MA104 клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: BHK-T7 (или BSR-T7) клетки не коммерчески доступны, но являются общей клеточной линии лабораторий с использованием обратной генетики для изучения биологии РНК вируса. Линия ячейки BHK-T7, используемая в этом протоколе, была получена от доктора Урсулы Бухгольц (Национальные институты здравоохранения, Bethesda, MD, США), соразработчика оригинальной линии клеток BHK, выражающей Полимеразу T7 РНК29. Клетки MA104 доступ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Обратный протокол генетики, описанный в этой статье, проходит через несколько различных шагов: (1) совместное трансфекцию клеток BHK-T7 с ротавирусными векторами транскрипции pT7 и пласмидом выражения pCMV/NP868R, (2) наблюдение за трансинфицированными клетками BHK-T7 с клетками MA104, (3) усиление рекомбинантных вирусов, присутствующих в лисатах клеток BHK-T7/MA104 с использованием клеток MA104, и (4) изоляции бляшек рекомбинантного вируса с использованием клеток MA104(рисунок 2). В наших р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В нашей лаборатории мы обычно полагаемся на описанный здесь протокол обратной генетики для производства рекомбинантных ротавирусов SA11. При таком подходе люди с небольшим опытом работы в методах молекулярной биологии или работающие с ротавирусами восстанавливают рекомбинантные вирусы даже с первой попытки. Мы создали около 100 рекомбинантных вирусов после этого протокола, в том числе с геномами, которые были переработаны, чтобы выразить иностранные белки (например, FPs) и которые содержат дополнения последовательности, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH гранты R03 AI131072 и R21 AI144881, Индиана университета Start-Up Финансирования, и Лоуренс М. Блатт фонда. Мы благодарим членов лаборатории IU Rotahoosier, Ульриха Дессельбергера и Гвидо Папа за их многочисленный вклад и предложения в разработке обратного протокола генетики.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Почка маленького хомяка - T7 RdRP (BHK-T7) Контакт с клетками | : ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% трис-глицина полиакриламид мини-гель | Bio-Rad | 45608105 | |
| Целлометр AutoT4 жизнеспособный счетчик клеток | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Компетентные бактерии E.coli DH5alpha | Lucigen | 60602-2 | |
| Полный ингибитор протеазы | Pierce | A32965 | |
| Одноразовые трансферные пипетки, ультратонкие расширенные наконечники | MTC Bio | P4113-11 | |
| Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Качественный биологический | 115-073-101 | |
| Этанол, абсолютный (200 proof) | Биореагенты Fisher | BP2818-500 | |
| Раствор бромида этидия (10 мг/мл) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS), термоинактивированная | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 антитело, мышиная моноклональная | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite | DMEM ThermoFisher | A1896701 | DMEM с низким фоном флуоресцентная |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Козья антикроличья IgG, пероксидаза хрена (HRP) Технология конъюгированной | клеточной сигнализации | 7074S | |
| Морская свинка Анти-NSP3 Антисыворотка | Паттона | лабораторная партия 55068 | |
| Морская свинка Анти-VP6 Антиерум | Паттон лабораторная | партия 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, пероксидаза хрена (HRP) Конъюгированная | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, хрен-эроксидаза (HRP) Технология конъюгированной | клеточной сигнализации | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Изопропиловый спирт | Macron | 3032-02 | |
| L-глутаминовый раствор ( 100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Порошок агара Luria (Miller's LB Agar) | Исследовательские продукты RPI | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Культуральная среда | Hyclone | sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Клетки почки обезьяны (MA104) ATCC | ATCC CRL-2378.1 | ||
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Нейтральный красный раствор (0,33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100 мл | |
| заменимых аминокислот (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% трис-глицин полиакриламид мини-гель | инвитроген | XP00102BOX | |
| нуклеазной воде класса молекулярной биологии | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Гель и набор для очистки ПЦР | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Сниженная сыворотка Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Пеллетный пестик (без РНКазы, одноразовый) | Fisher | 12-141-368 | |
| Раствор пенициллин-стрептомицина, (100x пенн-стрептококк) | Corning | 30-002-Cl | |
| Фосфат Буферный физиологический раствор (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Свиной трипсин, тип IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Транскрипционные векторы | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Транскрипционные векторы, экспрессирующие флуоресцентные белки | Контакт: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | Для гель-электрофореза |
| SeaPlaque | agarose Lonza | 50100 | Для анализа |
| бляшекSuperscript III Одноэтапный набор для ОТ-ПЦР | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Trans-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Биореагенты | BP151-500 | |
| Тризол РНК Экстракционный реагент | Ambion | 15596026 | |
| Трипановый синий | Corning | 25-900-CI | |
| Трипсин (0,05%)-ЭДТА (0,1%) Раствор для диссоциации клеток | Качество Биологический | 118-087-721 | |
| Триптозофосфатный бульон | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF растворитель | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Флуоресцентный формирователь изображений живых клеток | Bio-Rad |
Ссылки
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
