Этот метод описывает шаги по улучшению качества и количества последовательности данных, которые могут быть получены из формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) РНК образцов. Мы описываем методологию для более точной оценки качества образцов FFPE-РНК, подготовки библиотек секвенирования и анализа данных из образцов FFPE-РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизация для секвенирования и анализа деградированных образцов FFPE-РНК
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Анализ экспрессии генов с помощью секвенирования РНК (РНК-сек) позволяет получить уникальную информацию о клинических образцах, которые потенциально могут привести к механистическое понимание основы различных заболеваний, а также механизмов резистентности и/или восприимчивости. Тем не менее, ткани FFPE, которые представляют собой наиболее распространенный метод сохранения морфологии тканей в клинических образцах, не являются лучшими источниками для анализа экспрессии генов. РНК, полученная из таких образцов, часто деградирует, фрагментируется и химически модифицируется, что приводит к неоптимальному секвенированию библиотек. В свою очередь, они генерируют данные о низкой последовательности качества, которые могут быть ненадежными для анализа экспрессии генов и обнаружения мутаций. Для того чтобы максимально получить максимальную отдачу от образцов FFPE и получить наилучшие данные из образцов низкого качества, важно принять определенные меры предосторожности при планировании экспериментального проектирования, подготовке библиотек секвенирования и при анализе данных. Это включает в себя использование соответствующих метрик для точного контроля качества выборки (КК), определение лучших методов для различных шагов во время генерации библиотеки последовательности, и тщательной библиотеки КК. Кроме того, применение правильных программных средств и параметров для анализа последовательности данных имеет решающее значение для выявления артефактов в данных RNA-seq, фильтрации загрязнения и низкого качества считывания, оценки единообразия генного покрытия и измерения воспроизводимости профилей экспрессии генов среди биологических репликаций. Эти шаги могут обеспечить высокую точность и воспроизводимость для профилирования очень неоднородных образцов РНК. Здесь мы описываем различные шаги для образца КК, подготовки библиотеки и КК, секвенирования и анализа данных, которые могут помочь увеличить объем полезных данных, полученных из низкокачественной РНК, таких как полученные из тканей FFPE-РНК.
Введение
Использование подходов к секвенированию следующего поколения позволило нам получить большой объем информации из различных типов образцов. Однако старые и плохо сохранившиеся образцы остаются неработоспособными для широко используемых методов генерации данных о последовательности и часто требуют внесения изменений в устоявшиеся протоколы. Ткани FFPE представляют собой такой тип образца, который был широко использован для клинических образцов1,,2,,3. В то время как сохранение FFPE поддерживает морфологию тканей, нуклеиновые кислоты в тканях FFPE обычно обладают широким спектром....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Оценка количества и качества РНК
- Выберите образцы FFPE в соответствии с заранее определенными критериями и извлеките РНК с помощью соответствующего метода (например, комплект для извлечения кислоты FFPE,, Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько различных методов, доступных для экстракции FFPE-РНК, в том числе новые методы микродиссекции, которые могут работать с очень мало ткани и извлечь хорошее качество РНК12,13,14. - Необходимо позаботиться о сохранении целостности РНК на всех этапах. Это включает в себя работу с RNase свобо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Упомянутая выше методология была применена к 67 пробам FFPE, которые хранились в различных условиях в течение 7–32 лет (средний срок хранения выборки составлял 17,5 лет). Данные и результаты анализа, представленные здесь, были ранее описаны и опубликованы в Чжао и др.11. При проверке качества образца, как описано ранее (т.е. например, следы на рисунке 2),DV100 оказался более полезным, чем DV200, потому что он более чувствителен для точного измере.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанный здесь метод определяет основные шаги, необходимые для получения хороших данных о последовательности из образцов FFPE-РНК. Основными моментами, которые следует учитывать с помощью этого метода, являются: (1) Обеспечить, чтобы РНК сохранилась как можно лучше после извлечения путем минимизации циклов обработки образцов и замораживания и оттаивания. Отдельные аликоты КК очень полезны. (2) Используйте метрику КК, которая лучше всего подходит для данного набора образцов. Значения RIN и DV200 часто не полез.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Эта работа финансировалась Национальным институтом рака (НЦИ), Национальными институтами здравоохранения (НИЗ). Leidos Biomedical Research, Inc. является подрядчиком по эксплуатации и технической поддержке ВНеша. Несколько авторов (Y , MM, KT, YL, JS, BT) связаны с Leidos Biomedical Research, Inc., но все авторы полностью финансируются Национальным институтом рака, включая зарплаты авторов и исследовательские материалы. Компания Leidos Biomedical Research, Inc. не предоставила заработную плату авторам (Y, MM, KT, YL, JS, BT) или материалу для исследования, и не имела никакой роли в разработке, сборе данных, анализе, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Благодарности
Мы благодарны доктору Даниэль Кэррик (Отдел по борьбе с раком и наук о народонаселении, Национальный институт рака) за постоянную помощь, особенно за инициирование этого исследования, предоставляя нам образцы, и за полезные предложения во время анализа данных. Мы искренне благодарим всех членов CCR секвенирования фонда в Фредерик Ской Национальной лаборатории онкологических исследований за их помощь во время подготовки образцов и последовательности, особенно Бренда Хо за помощь в образце КК, Оксана Герман для библиотеки КК, Татьяна Смирнова для запуска секвенсоров. Мы также хотели бы поблагодарить Цай-вэй Шэня и Эшли Уолтон из Sequencing Facility Bioinformatics Group ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2100 Биоанализатор | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Набор | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent Высокочувствительный набор ДНК | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Сенсорная система | Bio-Rad | 1855195 | |
| Набор для количественного определения библиотеки v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBНext Ultra II Набор для подготовки библиотеки направленной РНК для Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBНестрикт для истощения рРНК (человек/мышь/крыса) | Новая Англия Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Система секвенирования | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 Руководство по системе: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | ||
| Магнитный сепаратор 10X Genomics | 10X Genomics 120250 | ||
| Мультимиксер Rotator | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Сенсорный термоамплификатор | Bio-Rad | 1851197 | |
| Набор реагентов для секвенирования | Illumina | 20024907 | |
| Пакет проточных ячеек | Illumina | 20024907 | |
| Буферный картридж и реагентный картридж | Illumina | 20024907 | |
| раствор гидроксида натрия (0,2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1,0M, pH 7,0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
Ссылки
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
- Hedegaard, J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
