אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר fDrug לטיפול בדלקות ריאות מתקדם לקראת חיזוי במודלים מוליטרו של מורכבות גבוהה. הנוכחות הרב-גפית של חיידקים במודלים של ריאות יכולה להתאים מחדש את הסידור האפיתל, בעוד תאים חיסוניים לתאם תגובה דלקתית נגד החיידקים בסביבה מיקרו. בעוד במודלים vivo היו הבחירה לבדיקת אנטי-זיהומים חדשים בהקשר של סיסטיק פיברוזיס, הם עדיין לא לחקות במדויק את תנאי vivo של מחלות כאלה בבני אדם ואת תוצאות הטיפול. מורכבים במודלים מולכיים של דרכי הנשימה הנגועות המבוססות על תאים אנושיים (אפיתל סיפונות וקרופאגים) ופתוגנים רלוונטיים יכולים לגשר על הפער הזה ולהקל על תרגום של נוגדי זיהומים חדשים למרפאה. למטרות כאלה, מודל תרבות שיתופית של סיסטיק פיברוזיס האנושית סימפונות קו תא אפיתל CFBE41o- ו THP-1 מונוציט נגזר מקרופאגים הוקמה, מחקה זיהום של רירית הסימפונות האנושית על ידי P. aeruginosa בממשק אוויר נוזלי (ALI) תנאים. מודל זה מוגדר בשבעה ימים, ואת הפרמטרים הבאים מוערכים בו זמנית: שלמות מחסום אפיתל, טרנסמיג מקרופאג,הישרדות חיידקים, ודלקת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת חזקה ותשובת להערכת יעילות התרופה ותגובות מארחות שיכולות להיות רלוונטיות לגילוי נוגדי זיהומים חדשים ולייטוב אספקת האירוסול שלהם לריאות.
מבוא
פסאודומונס aeruginosa הוא פתוגן רלוונטי סיסטיק פיברוזיס (CF) שתורם ליקוי רקמת ריאה1. הייצור של פוליסכרידים, כגון אלגינט ואקסופוליסכרידים אחרים, מתאם את התקדמות המחלה, מה שמוביל לדבקות חיידקים עקשנית, מגביל את אספקת אנטיביוטיקה לחיידקים ומגן על החיידקים מפני המערכת החיסוניתהמארחת 2. המעבר של P. aeruginosa מהשלב פלנקטוני להיווצרות biofilm הוא נושא קריטי בהקשר זה, גם להקל על המופע של סובלנות לאנטיביוטיקה.
בהקשר של CF, העכבר שימש בעיקר כמודל. עכברים, עם זאת, לא באופן ספונטני לפתח מחלה זו עם המבוא של מוטציות CF3. רוב פיתוח הביופילם החיידקי ותרופות רגישות מח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צמיחה והבידול של תאים בהוספת תמיכה חדיר
- לטפח CFBE41o- בקבוקון T75 עם 13 מ"ל של מינימום חיוני בינוני (MEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS), 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו 600 מ"ג / L גלוקוז ב 37 ° C עם 5 % CO2 אטמוספרה. מוסיפים מדיום טרי לתאים כל 2-3 ימים.
- נתק את התאים לאחר שהגיע 70% confluence בקבוקון עם 3 מ"ל של טריפסין- חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (EDTA) ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 7 מ"ל של MEM טרי וצנטריפוגה התאים ב 300 x g עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את הסופרנטנט והוספו 10 מ"ל חדשים של MEM תוך שיבוש הגושים על-ידי התפתלות בעדינות כלפי מטה.
- ספור את התאים עם מונה תא אוטומטי או תא המוציטומ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1A מראה את המורפולוגיה של התרבות ההפוכה של תאי אפיתל הסימונכיים האנושיים וקרופאגים לאחר גידול במשך 24 שעות בצד האפי והבסולטרלי של תמיכות חדירות, בהתאמה. שלמות מחסום האפיתל מוצגת על-ידי TEER גבוה יותר (834 Ω×cm2)ו- CLSM על-ידי חיסון עבור חלבון צומת הדוק ZO-1(איור 1B). אותן תוצאות שנצפו במונחים של שלמות מחסום של CFBE41o נגוע- monoculture ניתן לראות בתרבויות שיתוף אפיתל-מקרופאג נגוע.
כדי מודל זיהום חיידקי, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור תרבית 3D של דרכי הנשימה הנגועות, המהווה על ידי סיסטיק פיברוזיס הסימפונת הסימפונת קו תא CFBE41o- ואת קו תא מקרופאג מונוציט אנושי נגזר THP-1. הפרוטוקול מאפשר הערכה של שלמות מחסום אפיתל, תרדת מקרופאג, הישרדות חיידקים, ודלקת, שהם פרמטרים חשובים בעת בדיקת יעילות התרופה ותגובות מארח בו זמנית. החידוש במודל טמון בהתאגדות של תאי אפיתל (כלומר קו תא CF אנושי מקרופאגים) עם זיהום חיידקי חריף (כלומר P. aeruginosa). הזיהום החריף בתאי האפיתל הוכח להיות נשלט על ידי אנטיביוטיקה (כלומר tobramycin). מלבד .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לסופרים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו קיבלה מימון מתכנית HORIZON 2020 של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, והדגמה תחת הסכם מענק מס ' 642028 H2020-MSCA-ITN-2014, NABBA - עיצוב, ופיתוח של ננו-תרופות מתקדמות כדי להתגבר על מחסומים ביולוגיים ולטייסת במחלות קשות. אנו מודים לד"ר אנה קוסטה וד"ר ג'ני Juntke על התמיכה הגדולה על הפיתוח של התרבות ההפוכת, אולגה הרטוויג, על האיור המדעי, אניה Honecker, עבור ELISA assays, פטרה König, יאנה Westhues וד"ר קיארה דה רוסי על התמיכה בתרבות התא, ניתוח, ומיקרוסקופיה. אנחנו גם מודים לצ'לסי ת'ורן על הגהה של כתב היד שלנו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| Ampicillin | Carl Roth, גרמניה | HP62.1 | |
| CASY TT מונה תאים ומנתח | OLS Omni Life | Sciences-CellTrace | |
| Far Red | Thermo Fischer | C34564 | |
| צנטריפוגה אוניברסלית 320R | Hettich, גרמניה | 1406 | |
| CFBE41o- תאים | 1. תוכנית הפצת קו התאים של גרונרט 2. סיגמא-אולדריץ' | 1. מתנה מד"ר דיטר ס. גרונרט 2. סט אלקטרודות צ'ופסטיק SCC151 | |
| עבור EVOM2, | מכשירי דיוק עולמיים 4 מ"מ, סרסוטה, ארה"ב | STX2 | |
| CLSM | Leica, מנהיים, גרמניה | TCS SP 8 | |
| ציטוקינים ELISA ערכות Ready-SET-Go | Affymetrix eBioscience, ארה"ב | 15541037 | |
| פאנל ציטוקינים I ו-II | LEGENDplex Immunoassay (Biolegend, ארה"ב). | ||
| ערכת זיהוי ציטוטוקסיות 740102 (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) גלוקוז | Merck | 47829 | |
| Dako פלואורסצנטי הרכבה בינונית | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fischer | D1306 | |
| Epithelial voltohmmeter | מכשירי דיוק עולמיים, סרסוטה, ארה"ב | EVOM2 | |
| Falcon תמיכה חדירה לצלחת 12 בארות עם 3.0μ m ממברנת PET שקופה, | קורנינג סטרילי, אמסטרדם, הולנד | 353181 | |
| סרום עגל עוברי | לונזה, באזל, שוויץ | DE14-801F | |
| נוגדן משני נגד עכבר עיזים (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-Lactate Dehydrogenase (LDH), שריר הארנב | רוש, מנהיים, גרמניה | 10127230001 | |
| LB מרק | סיגמא-אולדריץ', גרמניה | L2897-1KG | |
| MEM (מדיום חיוני מינימלי) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X) | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| P. aeruginosa זן PAO1 | American Type Culture Collection | 47085 | |
| P. aeruginosa זן PAO1-GFP | American Type Culture Collection | 10145GFP | |
| Paraformaldehyde תמיסה מימית -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| מאגר תמיסת חיץ פוספט | Thermo Fischer | 10010023 | |
| צלחות פטרי | Greiner | 664102 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | סיגמא, גרמניה | P8139-1MG | |
| משקפי כיסוי מדויק | ThorLabs | CG15KH | |
| עכבר מטוהר אנטי-אנושי ZO-1 IgG נוגדן | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני | Gibco by Lifetechnologies, פייזלי, בריטניה | ||
| צלחת פטרי מזכוכית סודה-ליים, 50 x 200 מ"מ (גובה x קוטר חיצוני) | נורמקס, פורטוגל | 5058561 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich, גרמניה | S4521 | |
| T75 | Thermo Fischer | 156499 | |
| תאי THP-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ; בראונשווייג, גרמניה) | לא. ACC-16 | |
| מלח טוברמיצין סולפט | סיגמא | T1783-500MG | |
| טריפסין-EDTA 0.05% | תרמו פישר | 25300054 | |
| Tween80 | סיגמא-אולדריץ', גרמניה | P1754 |
מקורות
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa inf....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
