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方法論記事

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

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DOI:

10.3791/61069

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2020年6月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Drug Delivery, Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), 2Department of Pharmacy, Saarland University, 3Department of Vaccinology and Applied Microbiology, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Department of Internal Medicine V - Pulmonology, Allergology, Respiratory Intensive Care Medicine, Saarland University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

我々は、CFBE41o-細胞、THP-1マクロファージ、および空気液体界面-で確立された緑膿菌を用いて、感染した気道の3次元共培養モデルのプロトコルについて説明する。このモデルは、抗生物質の有効性、上皮バリア機能、および炎症マーカーを同時にテストするための新しいプラットフォームを提供します。

要約

肺感染症の治療のためのfDrug研究は、高い複雑さのイン ビトロ モデルの予測に向かって進んでいます。肺モデルにおける細菌の多面的存在は上皮配列を再適応させることができ、免疫細胞は微小環境における細菌に対する炎症反応を調整する。 生体内 モデルは嚢胞性線維症の文脈で新しい抗感染薬をテストするための選択であったが、彼らはまだヒトにおけるそのような疾患の インビボ 状態および治療結果を正確に模倣していない。ヒト細胞(気管支上皮およびマクロファージ)および関連する病原体に基づく感染気道の複雑な in vitro モデルは、このギャップを埋め、新しい抗感染薬のクリニックへの翻訳を容易にする可能性がある。このような目的のために、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41oと THP-1単球由来マクロファージの共培養モデルが確立され、空気液体界面(ALI)状態における 緑化 症によるヒト気管支粘膜の感染を模倣した。このモデルは7日間で設定され、次のパラメータが同時に評価されます:上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症。本プロトコルは、新しい抗感染薬の発見と肺へのエアロゾル送達の最適化に関連する可能性のある薬物有効性および宿主応答を評価するための堅牢で再現可能なシステムを記述する。

概要

緑膿菌 は、肺組織障害に寄与する嚢胞性線維症(CF)に関連する病原体である。アルギン酸および他の粘液性エキソ多糖などの多糖類の生産は、粘り強い細菌の付着をもたらす疾患の進行を調整し、細菌への抗生物質の送達を制限し、宿主免疫系2に対して細菌を保護する。 P.緑素症 の段階からバイオフィルム形成への移行は、この文脈において重要な問題であり、また抗生物質耐性の発生を促進する。

CFのコンテキストでは、マウスは主にモデルとして使用されています。しかし、マウスはCF変異3の導入により、この疾患を自発的に発症しない。細菌バイオフィルムの開発および薬物感受性の研究のほとんどは、ペトリ皿などの生物的表面で行われてきた。ただし、この方法は in vivoの複雑さを表すものではありません。例えば、免疫細胞や粘膜上皮を含む重要な生物学的障壁は存在しない。P.緑素吸い道は上皮細胞に非常に有毒であるが、いくつかのグループは、ヒト気管支細胞と以前のP.緑素吸膜を共同培養することができました。これらの細胞は、CFTR突然変異を有する嚢胞性線維症患者(CFBE41o-細胞)4に由来し、抗生物質有効性5を評価するか、または感染時にCFTRタンパク質の補正を評価することを許可した6。-このようなモデルは、薬剤の有効性の予測可能性を向上させることが示されたが、薬剤開発の後の段階で失敗した薬物の問題の特徴付けを可能にすることに加えて7。

しかし、肺では、粘膜上皮が空気にさらされる。また、気道に存在する免疫細胞は、組織マクロファージのように、吸入病原体または粒子8に対して必須の役割を果たす。マクロファージは、気管支内腔に到達し、感染と戦うために異なる細胞層を介して移動します。さらに、吸入薬物はまた、肺空気・血液関門9の追加の非細胞元素としての粘液の存在に対処しなければならない。実際、インビボの関連性を高め、いくつかの複雑な3次元(3D)インビトロモデルが開発されました。共培養システムは、創薬のためのin vitroシステムの複雑さを高めるだけでなく、細胞と細胞の相互作用を研究することを可能にします。このような複雑さは、マクロファージ遊走10に関する研究において取り組み、好中球11による抗菌ペプチドの放出、感染における粘液の役割9、及び上皮細胞反応を過剰損傷12に対する。しかし、CFの遺伝子変異を特徴とする信頼性の高いCF感染型インビトロモデルは、空気にさらされ(生理学的状態が増加する)、免疫細胞を統合することは依然として欠けている。

このギャップを埋めるために、我々は、感染した気道の安定したヒト3D共培養のためのプロトコルを記述する。このモデルは、ヒトCF気管支上皮細胞およびマクロファージで構成され、P.緑内膜に感染し、拡散性および免疫学的障壁の両方を表すことができる。合理的に高いスループットで抗感染薬をテストするという目標を持つこの共培養は、2つのヒト細胞株CFBE41oとTHP-1単球由来マクロファージを使用して、-ウェルプレートインサートの透過性フィルター膜に確立されました。さらに、最終的にエアロゾル化抗感染剤13の沈着を研究するために、このモデルは液体被覆条件(LCC)ではなく空気液体界面(ALI)で確立された。

ここで報告するように、このモデルは、抗生物質治療時の細菌生存期間だけでなく、細胞毒性、上皮バリア完全性、マクロファージ転移、および薬物開発に不可欠な炎症反応を評価することを可能にする。

このプロトコルは、肺気道の吸入療法のための2つの関連する細胞タイプを組み合わせた:マクロファージとCF気管支上皮。これらの細胞は、透過性支持口の反対側に播種され、空気への細胞暴露を可能にする(空気/液体界面(ALI)条件と呼ばれる)。この宿主細胞の共培養は、その後、P.緑素吸い星に感染する。両方の宿主細胞株はヒト由来である:上皮細胞は嚢胞性線維症気管支上皮を表し、CFチャネル(CFBE41o-)に変異を有-し、THP-11414細胞は、よく特徴付けられたマクロファージ様細胞株である。コンフルエント上皮層は、マクロファージ様細胞が反対側のコンパートメントに加える前に、まずウェルプレート挿入物の上側に形成される。ALIで共培養が確立されると、システムは、アプリーカル側のP.緑素吸着で接種されます。この感染した共培養システムは、例えばトブラマイシンなどの抗生物質の有効性を評価するために使用される。次のエンドポイントを分析する:経上皮電気抵抗(TEER)の点で上皮バリア完全性、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)による細胞細胞および細胞細菌相互作用の可視化、コロニー形成単位(CFU)のカウントによる細菌生存、宿主細胞生存(細胞毒性)およびサイトカイン放出。

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プロトコル

1. 透過性支持インサートにおける細胞の増殖と分化

  1. CFBE41oを栽培- 10%胎児子牛血清(FCS)、1%非必須アミノ酸および5%CO2雰囲気を有する37°Cで600mg/Lグルコースを含む最小必須培地(MEM)の13 mLを有2するT75フラスコで。2~3日ごとに新鮮な培地を細胞に加えます。
    1. 3 mLのトリプシン-エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)を37°Cで15分間、フラスコで70%合流した後、細胞を取り外します。新鮮なMEMの7 mLを加え、室温(RT)で4分間300 x g で遠心分離します。上清を捨て、新しい10 mLのMEMを追加しながら、上下に軽くピペットを入れて塊を混乱させる。
    2. 自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターチャンバーを持つ細胞を数えます。透過性サポートを備えた12ウェルプレートの密度が2 x 105の セル/ウェルのシードセル(孔径3μm、 材料表を参照)。
      注: 自動セル カウンタは、セルの数、サイズの分布、およびセルの生存率を決定します( 表を参照)。0.4 μmの孔径を有する透過性サポートを使用することができます。しかし、この状態ではマクロファージは、直接、アプリカル側に追加されるべきであり、その細胞間移動は、この場合評価されません。
    3. 液体液体状態(LLC)で細胞をシードし、透過性支持体の補助側に500μLの細胞懸濁液を加え、バソラテラ側に1.5mLの新鮮な培地を加えた。その後、37°Cの5%CO2下で2細胞を72時間インキュベートする。
    4. 空気/液体界面(ALI)培養に移行するには、播種後3日目に、まずバソラハレ側から培地を取り出し、次に、アペカル側から培地を取り出す。バソララル側に、500 μLの新鮮なMEMを加え、細胞がコンフルエント単層になるまで2日ごとに培地を交換します。
      注:このプロトコルで使用される条件については、CFBE41o- 細胞は通常、培養中の3〜7日後にコンフルエントです。
    5. CFBE41o-アペカル側に500μLの細胞培地、バソラテラ側に1.5mLの細胞を1時間、37°Cで5%CO2の下でインキュベートすることにより、7日目の上皮バリア2特性を評価する。
    6. STX2箸電極と上皮ボルトオームメーターを用いた経上皮電気抵抗(TEER)を介してバリア特性を測定する。7日後、これは300 Ω×cm²より高くなります。
      注:最終的には、いくつかの膜挿入物では、細胞は低いTEERを有する。そのため、TEER < 300 Ω×cm² の透過性インサートは使用されません。
  2. THP-1細胞を培養するには、10%のFCSを添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地の13mLを使用してT75フラスコで増殖させ、5%CO2の下で37°Cでインキュベートする。2新しいT75フラスコに2 x 106細胞/mL細胞を播種して、2日ごとに細胞を分割します。
    注:非分化THP-1細胞は、懸濁液中に単球として増殖する。
    1. THP-1細胞を以下のように分化する。300 x gで T75 の遠心分離機内容を 4 分間使用します。上清を捨て、新鮮な培地でペレットを再中断し、新しいT75に入れます。10 ng/mLのフォルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA)を加えて、37°Cおよび5%CO2雰囲気15で48時間2RPMI中の細胞をインキュベートする。
      注:PMAで分化した後、細胞は増殖しなくなり、フラスコに付着します。
    2. THP-1マクロファージ様細胞を剥離するには、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cで1回洗浄し、室温で10分間0.5mMEDTAを含む3mLの細胞剥離液(例えばアキュターゼ)でインキュベートする。
    3. 反転顕微鏡下で細胞を検査し、細胞剥離を探します。RTで4分間300 x g で新鮮な培地と遠心分離機の7 mLを追加します。
      注:マクロファージはトリプシンEDTA、37°Cで20分間取り外すこともできます。しかし、トリプシンは、選択した細胞剥離溶液よりもマクロファージに対してより厳しい( 材料表を参照)。
    4. 上清を除去した後、THP-1培地の3mLのマクロファージ細胞を15mL円錐管に再懸濁し、1.1.2に記載されているように細胞を数える。共培養を設定する前に、37°CのCO2 の下で最大1時間インキュベートします。
      注:THP-1細胞を懸濁液中に、生存性染料で染色して、さらに共培養を画像化することができる。このステップでは、以下の手順を実行します(ステップ 1.2.5)。
    5. 細胞生存率染料の10μMを含むマクロファージの染色(細胞内エステラーゼによるアセテート部分の変換に基づく、材料表を参照)、細胞生存性色素の3μLが細胞懸濁液に適用される。細胞を37°C、5%CO2で20分間インキュベー2トし、PBS 37°Cで1回洗浄して色素を除去します。
      注:細胞を遠心分離し、室温(RT)で4分間300 x g で色素を除去します。

2. 透過性支持体上における上皮マクロファージ共文化の確立

  1. CFBE41o- TEER ≥ 300 Ω×cm² (ステップ 1.1.6.下の部屋から培地を取り出し、滅菌ガラスペトリ皿(50mm x 200mm)内の支持体を慎重に反転させ、細胞スクレーパーを使用して膜底面の膜孔を介して生い茂った細胞を取り除きます。
    注:3μmの細孔サイズのため、上皮細胞は毛穴を通ってバソアテラザル側に向かって成長する傾向があります。したがって、この側にマクロファージを追加する前にそれらを削除する必要があります。CFBE41o-肺上皮細胞はこの工程で染色することができる。-ステップ 1.2.5 の手順を使用できます。しかし、細胞懸濁液の代わりに、MEMの色素溶液は、透過性支持体上の接着された細胞に(500 μLの素端側のみ)適用されます。
  2. PMA分化THP-1マクロファージの細胞懸濁液から2 x 105 細胞/ウェル(RPMIの200 μL)を使用し、細胞を反転インサートのバソラテラ側側に配置します。
  3. ペトリ料理を慎重に閉じ、5%CO2の下で37°Cで2時間2インキュベートします。
  4. インサートを12ウェルマイクロプレートに戻し、透過性インサートのバソラテラレ側にMEM培地500 μLを加えてALI条件を維持します。細胞は今感染の準備ができています。

3. P. 緑素症による感染

注:ここからのすべての次の手順は、バイオセーフティレベル2(BSL2)の研究室で行う必要があります。

  1. 15 mL のリゾゲニーブロス(LB)を、エルレンマイヤーフラスコ(50 mL)に300 μg/mL アンピシリンを補充し 、P. 緑化素吸 葉PAO1-GFPの単一コロニーを有する。
    注 :P.緑素吸いの 他の株は、例えば、PAO1野生型、PA14、または臨床株、独自の栽培プロトコルに従って、ここでも使用することができます。
  2. 37°Cで18時間培養し、180rpmで振る。
  3. 18時間後に50mLの円錐管と遠心分離機を3850 x g で5分間移動します。上清を捨て、37°Cで10mLの無菌PBSを加えます。
  4. 波長600nmの分光光度計で光学濃度を測定し、細胞培養培地を用いて細菌の濃度を2 x 105 CFU/mLの最終濃度に調整します。これは、上皮細胞1個につき1つの細菌の多重性感染(MOI)に相当する。
  5. 透過性支持体の頂部側に100μLの細菌懸濁液を加え(ステップ2.4)、37°Cで5%CO2下で21時間インキュベートし、細胞に細菌が付着できるようにします。その後、アリの状態を復元するためにピペットで慎重にアプリカル液体を除去します。いくつかのサンプルをコントロールとして感染させないようにします。
    注:この段階では、取り付けられた細菌はLB寒天(ステップ5.4/5.5を参照)でメッキして、初期細菌接種を決定する必要があります。
  6. 細胞内の細菌接着後に目的の薬物をインキュベートする。治療実験では、500μLの薬物溶液を細胞培地で希釈し(このプロトコルではトブラマイシン6μg/mLを使用)をアプリカル側に加えます。バソラテラ側に薬物を含まない1,500μLの細胞培地を加えます。
    注:溶液として薬物を植え付ける代わりに、モデルはまた、エアロゾル堆積に適応させることができます。このような目的のために、ALIの細胞は500μLの細胞培地をバソラテラ側から供給される。次いで、薬剤はまず噴霧され、適切な装置によって尖体コンパートメントに沈着する(ここでは説明しない)。感染したサンプルおよび処理されたサンプルは、セクション 4 ~ 7 で概説されているエンドポイントを確認できます。このステップから、透過性支持体は、画像(セクション4)を作成したり、細菌の増殖や哺乳動物細胞の生存率の結果を得るために使用することができます(セクション5-7)。

4. 共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)のサンプル調製

  1. 共培養、感染症および薬物治療の確立後、全ての培地を補助側およびバソラショナル側から除去する。37°CでPBSで1xを洗浄し、RT(バヒラテラ上の300 μLで300 μL)で1時間、3%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。細胞核は、室温で30分間、DAPI-PBSの5μg/mLで染色されます。
    注意: PFA は危険です。
  2. メスを使用して膜を切り取り、取り付け媒体を使用して2つの12 mm顕微鏡カバースライドの間に配置します( 材料表を参照)。フローベンチ内で30分間乾燥させてから、4°Cで保管します。 共焦点走査顕微鏡で可視化。
    注:共培養後および取り付け前に、緊密な接合部の免疫染色を行うことができます。そのために、細胞は30分間パラホルムアルデヒド3%で固定され、PBSで再び洗浄され、PBSでサポニン0.05%/BSA1%で透過化される。このプロトコルでは、ゾヌラオクルデンタンパク質(ZO-1)をマウス抗ヒトZO-1抗体(1:400、一晩4°Cでインキュベーション)を介して検出した。その後、サンプルをヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor 633(赤で1:2000)でRTで2時間インキュベートした。核はDAPI(1 μg/mL)で染色され、カバースリップに取り付け媒体で取り付けられました。
  3. 保存された膜を画像化するために共焦点顕微鏡を使用してください。検出のために405、488、505または633 nmの25xまたは63x水浸しの目標およびレーザーを選び、画像の解像度は 1024 x 1024 ピクセルでなければなりません。
    注:レーザーは使用する汚れに応じて選択されます。
  4. アペリアビューと断面ビューを取得し、イメージングソフトウェアを使用した3次元モデルの構築にゼータスタックモード(10~15スタック)を使用します。

コロニー形成ユニット(CFU)による細菌増殖の測定

  1. 非付着菌のCFUを評価するために、補助およびバソラショナル培地(細菌を含む)を収集します。補助側とバソラテラの側面から500 μLを集めて、それらをプールします。
    注:この懸濁液を直接使用して、細菌(ステップ5.4)または遠心分離機を21,250 x gで10分間カウントして、上清(セクション6)から乳酸脱水素酵素(LDH)を評価したり、PBSで再懸濁して細胞外細菌を数えたりします(ステップ5.4)。
  2. 透過性支持体の各区画に500 μLの無菌脱イオン冷水を添加することにより、細胞内に付着および/または内在化された細菌の生存を評価します。室温で30分間細胞をインキュベートする。
    注:サンプルは、LB寒天(ステップ5.4を参照)または後でめっきするために-20°Cで凍結(全体の挿入プレート)にメッキすることができます。
  3. 接着/内在細菌のCFUを評価するために、37°Cでサンプルを10分間解凍します(凍結した場合)。各ウェルのピペットチップを使用して、膜表面とピペットを上下に削り取り、すべての付着した内容を除去します。
    注:このステップでは、すべての上皮細胞が分解され、接着/内在細菌がメッキされる懸濁液として利用可能です。
  4. 両方の分画から細菌懸濁液を使用して、PBSでTween-80 0.05%を使用して1/10連続希釈を行い、LB寒天プレートに細菌をプレートします。
    注: 1 ~ 10 の希釈が推奨されます。細菌は、単一のコロニーが最初に同定される最も高い希釈で数えられるべきである。
  5. 郡のコロニーに対して16~72時間30°Cの寒天プレートをインキュベートし、それに応じてCFUを計算します。
    注:プレートインキュベーション時の温度は、処理サンプルに不可欠であり、コロニーの遅延成長を観察するために必要です。

6. 乳酸デヒドロゲナーゼアッセイによる細胞細胞毒性の評価

  1. LDHアッセイ16の細胞生存率評価には、細菌を含む感染細胞の上清(ステップ5.1から)を使用する。21,250 x g で上清を10分間遠心分離し、細菌をペレットし、最終的に残りの細胞をペレット化する。LDH放出を測定するために細菌を含まない上清を使用してください。
    注:上清は、このアッセイでLDHを測定する前に凍結してはなりません。
  2. 上清100μLを96ウェルプレートに移し、LDHアッセイ溶液を100μL加えます( 材料表参照)。暗い所で室温で5分間インキュベートし、492nmで吸光度を読み取る。

7. ヒトサイトカインの放出の評価

  1. サイトカイン定量の場合、ELISAまたはサイトメトリックビーズアレイイムノアッセイ17を使用します( 材料表を参照)。このために、ステップ5.1から遠心分離機上清は21,250 x g で10分間、分析まで15日間まですぐに測定するか、-80°Cを保存します。
  2. 市販のELISAキットで上清を評価します。
    注:この手順は、捕獲抗体によるプレートのコーティング、サンプル(100 μL)およびサイトカイン標準の追加、インキュベーション、洗浄、および検出抗体の追加を含む製造手順に従い、サイトカイン存在の着色測定を提供します。あるいは、フローサイトメトリーは、市販のキットを介してサイトカインを測定するために使用することができます( 材料表を参照)。

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結果

図1A は、それぞれ、透過性支持体の頂部側およびバソラショナル側で24時間成長した後のヒト気管支上皮細胞とマクロファージの共培養の形態を示す。上皮バリア完全性は、より高いTEER(834Ω×cm2)およびCLSMにより、密接結合タンパク質ZO-1に対する免疫染色によって示される(図1B)。感染していないCFBE41oのバリア完全性の観点から観察された同じ結果は 、感染していない上皮マクロファージ共培養で単一培養が見られた。

細菌感染をモデル化するために、P.緑素吸皮症はCFBE41o細胞上で1:1の多重感染(MOI)で接種された。感染から6時間後(図2A)、共培養の頭側にマクロファージが認められた。感染後、TEERは834から250Ω×cm2に低下2し、ZO-1染色によっても可視化されるように、侵害さ...

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ディスカッション

本論文は、ヒト嚢胞性線維症気管支上皮細胞株CFBE41o-およびヒト単球由来マクロファージ細胞株THP-1によって構成される、感染した気道の3D共培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、上皮バリアの完全性、マクロファージの移行、細菌の生存、および炎症の評価を可能にし、薬物の有効性と宿主応答を同時に検査する際の重要なパラメータである。モデルにおける新規性は、急性細菌感染(すなわちP.Eeruginoa)を有する上皮細胞(すなわちヒトCF細胞株およびマクロファージ)の組み込み内にある。上皮細胞における急性感染は、抗生物質(すなわちトブラマイシン)によって制御することが実証される。ヒトCF細胞株の使用に加えて、モデル全体がALI条件で設定され、CFの生理学的条件にかなり近い。CF細胞株の使用は、モデルにおける疾患の特徴の一部を実装する。嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節器(CFTR)の変異は、肺における上皮液輸送の調節不変に直接関係する。さらに、ΔF508のようなCF遺伝子の変異は、P.緑素吸いによる4感染時に炎症および重度の肺損傷を伴う、...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、欧州連合(EU)のHORIZON 2020プログラムから、補助金契約第642028 H2028-MSCA-ITN-2014、NABBA - 生物学的障壁を克服し、重篤な疾患を治療するための高度なナノ医薬品の設計と開発に基づく研究、技術開発、デモンストレーションのための資金を受け取りました。アナ・コスタ博士とジェニー・ユントケ博士は、ELISAアッセイ、ペトラ・ケーニッヒ、ジャナ・ウェストヒュース、キアラ・デ・ロッシ博士の細胞培養、分析、顕微鏡コピーに関するサポートに対する科学的イラスト「アンジャ・ホーネッカー」に対する共文化の発展に大きな支援をしてくれたことに感謝します。また、原稿を校正してくれたチェルシー・ソーンに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AccutaseAccutaseAT104
AmpicillinCarl Roth, GermanyHP62.1
CASY TT Cell Counter and AnalyzerOLS Omni Life Sciences-CellTrace
Far RedThermo FischerC34564
Centrifuge Universal 320RHettich, Germany1406
CFBE41o-セル1.Gruenert Cell Line Distribution Program
2.シグマ・アルドリッチ		1. ディーター・C・グルーナート博士からの贈り物
2.SCC151
EVOM2用チョップスティック電極セット 4mmWorld Precision Instruments, Sarasota, USASTX2
Confocal Laser-Scanning Microscope CLSMLeica, Mannheim, GermanyTCS SP 8
Cytokines ELISA Ready-SET-Go kitsAffymetrix eBioscience, USA15541037
Cytokines Panel I and IILEGENDplex Immunoassay (Biolegend, USA).
740102 細胞毒性検出キット (LDH)ロシュ11644793001
D-(+) グルコースメルク47829
Dako 蛍光 実装 媒体DAKOS3023
DAPI (4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)サーモフィッシャーD1306
上皮ボルトHM計World Precision Instruments,サラソタ、米国EVOM2
Falcon 透過性サポート 12 ウェルプレート用 3.0μm Transparent PET Membrane, SterileCorning, Amsterdam, Netherlands353181
Fetal calf serumLonza, Basel, SwitzerlandDE14-801F
ヤギ抗マウス (H+L) 交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 633InvitrogenA-21050
L-乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH), rabbit muscleRoche, Mannheim, Germany10127230001
LBブロスSigma-Aldrich, GermanyL2897-1KG
MEM (Minimum Essential Medium)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.
非必須アミノ酸溶液 (100X)Gibco Thermo Fisher Scientific Inc.
P. aeruginosa 株 PAO1アメリカンタイプカルチャーコレクション47085
P. aeruginosa strain PAO1-GFPアメリカンタイプカルチャーコレクション10145GFP
パラホルムアルデヒド水溶液 -16%EMS DIASUM15710-S
リン酸緩衝液 緩衝液サーモフィッシャー10010023
ペトリ皿Greiner664102
Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)Sigma, GermanyP8139-1MG
Precision Cover GlassesThorLabsCG15KH
Purified Mouse anti-human ZO-1 IgG antibodyBD Transduction Laboratories610966
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumGibco by Lifetechnologies, Paisley, UK
ソーダライムガラス ペトリ皿、50 x 200 mm (高さ x 外径)ポルトガル、ノーマックス5058561
SaponinSigma-Aldrich, ドイツS4521
T75 培養フラスコThermo Fischer156499
THP-1 cellsDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ;ブラウンシュヴァイク、ドイツ)いいえ。ACC-16
トブラマイシン硫酸塩ΣT1783-500MG
トリプシン EDTA 0.05%サーモフィッシャー25300054
Tween80Σ - アルドリッチ、ドイツP1754
110950721114005011875093

参考文献

  1. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  2. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: Lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  3. Wilke, M., Buijs-Offerman, R. M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: Phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, SUPPL. 2 152-171 (2011).
  4. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 21 (4), 595-599 (2008).
  5. Yu, Q., et al. In vitro evaluation of tobramycin and aztreonam versus Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived human airway epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (11), 2673-2681 (2012).
  6. Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. a, Anderson, G. G. Co-culture models of Pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (44), e2186(2010).
  7. Stanton, B. A., Coutermarsh, B., Barnaby, R., Hogan, D. Pseudomonas aeruginosa reduces VX-809 stimulated F508del-CFTR chloride secretion by airway epithelial cells. PLoS ONE. 10 (5), 1-13 (2015).
  8. Lambrecht, B. N., Prins, J., Hoogsteden, H. C. Lung dendritic cells and host immunity to infection. European Respiratory Journal. (18), 692-704 (2001).
  9. Murgia, X., De Souza Carvalho, C., Lehr, C. M. Overcoming the pulmonary barrier: New insights to improve the efficiency of inhaled therapeutics. European Journal of Nanomedicine. 6 (3), 157-169 (2014).
  10. Ding, P., Wu, H., Fang, L., Wu, M., Liu, R. Transmigration and phagocytosis of macrophages in an airway infection model using four-dimensional techniques. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (1), 1-10 (2014).
  11. Hartl, D., Tirouvanziam, R., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
  12. Esposito, S., et al. Manipulating proteostasis to repair the F508del-CFTR defect in cystic fibrosis. Molecular and cellular pediatrics. 3 (1), 13(2016).
  13. Hein, S., Bur, M., Schaefer, U. F., Lehr, C. M. A new Pharmaceutical Aerosol Deposition Device on Cell Cultures (PADDOCC) to evaluate pulmonary drug absorption for metered dose dry powder formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (1), 132-138 (2011).
  14. Kletting, S., Barthold, S., et al. Co-culture of human alveolar epithelial (hAELVi) and macrophage (THP-1) cell lines. Altex. 35 (2), 211-222 (2018).
  15. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1,25-dihydroxyvitamin D3. Journal of leukocyte biology. 59 (4), 555-561 (1996).
  16. Castoldi, A., Empting, M., et al. Aspherical and Spherical InvA497-Functionalized Nanocarriers for Intracellular Delivery of Anti-Infective Agents. Pharmaceutical Research. 36 (1), 1-13 (2019).
  17. Ebensen, T., Delandre, S., Prochnow, B., Guzmán, C. A., Schulze, K. The Combination Vaccine Adjuvant System Alum/c-di-AMP Results in Quantitative and Qualitative Enhanced Immune Responses Post Immunization. Frontiers in cellular and infection microbiology. 9, 31(2019).
  18. Brockman, S. M., Bodas, M., Silverberg, D., Sharma, A., Vij, N. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues δF508-CFTR and inhibits Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis. PLoS ONE. 12 (9), 1-17 (2017).
  19. Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infection and Immunity. 76 (4), 1423-1433 (2008).
  20. Moreau-Marquis, S., Bomberger, J. M., et al. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 295, 25-37 (2008).
  21. Braakhuis, H. M., Kloet, S. K., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  22. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 4-7 (2016).
  23. Daigneault, M., Preston, J. a, Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 5 (1), (2010).
  24. Bismarck, P. V., Schneppenheim, R., Schumacher, U. Successful treatment of pseudomonas aeruginosa respiratory tract infection with a sugar solution - A case report on a lectin based therapeutic principle. Klinische Padiatrie. 213 (5), 285-287 (2001).
  25. Klinger-Strobel, M., Lautenschläger, C., et al. Aspects of pulmonary drug delivery strategies for infections in cystic fibrosis - where do we stand. Expert Opinion on Drug Delivery. 5247, 1-24 (2015).
  26. Ehrhardt, C., Collnot, E. -M., et al. Towards an in vitro model of cystic fibrosis small airway epithelium: characterisation of the human bronchial epithelial cell line CFBE41o-. Cell and tissue research. 323 (3), 405-415 (2006).
  27. Anderson, G. G., Kenney, T. F., Macleod, D. L., Henig, N. R., O'Toole, G. A. Eradication of Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured airway cells by a fosfomycin/tobramycin antibiotic combination. Pathogens and Disease. 67 (1), 39-45 (2013).
  28. Cavalieri, F., Tortora, M., Stringaro, A., Colone, M., Baldassarri, L. Nanomedicines for antimicrobial interventions. Journal of Hospital Infection. 88 (4), 183-190 (2014).
  29. Savla, R., Minko, T. Nanotechnology approaches for inhalation treatment of fibrosis. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 914-925 (2013).
  30. Ho, D. -K., et al. Challenges and strategies in drug delivery systems for treatment of pulmonary infections. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 144, 110-124 (2019).

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