我们描述了一种用于感染气道的三维共培养模型的实验方案，该模型在气液界面处建立，使用CFBE41o-细胞、THP-1巨噬细胞和Pseudomonas aeruginosa。该模型提供了一个新平台，可同时检测抗生素疗效、上皮屏障功能以及炎症标志物。
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方法文章
P. aeruginosa 感染的支气管上皮细胞与巨噬细胞在气液界面的三维共培养模型用于抗感染药物的临床前评价
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摘要
摘要
针对肺部感染治疗的药物研究正朝着高复杂性的预测性体外模型方向发展。在肺部模型中，细菌的多重存在可重新调整上皮细胞的排列结构，同时免疫细胞在微环境中协调针对细菌的炎症反应。尽管体内模型一直是囊性纤维化背景下测试新型抗感染药物的首选，但其仍无法准确模拟人类此类疾病的体内真实状况及治疗效果。基于人源细胞（支气管上皮细胞和巨噬细胞）和相关病原体构建的复杂体外感染气道模型有望填补这一空白，并促进新型抗感染药物向临床应用的转化。为此，已建立一种人囊性纤维化支气管上皮细胞系CFBE41o-与THP-1单核细胞来源巨噬细胞的共培养模型，用于模拟铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）在气液界面（ALI）条件下对人支气管黏膜的感染。该模型可在七天内构建完成，并可同时评估以下参数：上皮屏障完整性、巨噬细胞跨膜迁移、细菌存活率以及炎症反应。本方案描述了一种稳健且可重复的系统，可用于评估药物疗效及宿主反应，对发现新型抗感染药物及其肺部气溶胶递送的优化具有重要意义。
引言
Pseudomonas aeruginosa 是囊性纤维化（CF）中一种重要的病原体，可导致肺组织损伤1。该菌产生藻酸盐及其他黏液型胞外多糖，这些多糖调控着疾病的发展进程，导致细菌牢固黏附、限制抗生素向细菌递送，并保护细菌免受宿主免疫系统的攻击2。P. aeruginosa 从浮游状态向生物膜形成的转变在此过程中尤为关键，同时也促进了细菌对抗生素耐受性的产生。
在囊性纤维化（CF）的研究中，小鼠主要被用作模型动物。然而，引入CF突变后，小鼠并不会自发地产生该疾病3大多数细菌生物膜形成及药物敏感性研究均在非生物表面（如培养皿）上进行。然而，这种方法并不能真实反映 体内 复杂性。例如，一些重要的生物屏障不存在，包括免疫细胞以及黏膜上皮。尽管 P. aeruginosa 对上皮细胞具有相当的毒性，一些研究团队 已成功共培养较早期的 P. aeruginosa 携带CFTR突变的囊性纤维化患者来源的人支气管细胞形成的生物膜（CFBE41o）- 细胞4 并允许评估抗生素的疗效5 或评估感染期间CFTR蛋白的校正情况6该模型不仅能够提高药物疗效的可预测性，还可用于表征在药物研发后期阶段失败的药物所存在的问题。7.
然而，肺部的黏膜上皮暴露于空气中。此外，存在于呼吸道中的免疫细胞（如组织巨噬细胞）在抵御吸入性病原体或颗粒物方面发挥着关键作用。8巨噬细胞穿过不同的细胞层，迁移至支气管腔以清除感染。此外，吸入性药物还需应对黏液的存在，黏液是肺部气-血屏障中一种额外的非细胞成分。9确实，一些复杂的三维（3D） 体外 已开发出多种模型，旨在提高 体内 相关性。共培养系统不仅增加了复杂性 体外 用于药物发现的系统，还能用于研究细胞间相互作用。此类复杂性已在关于巨噬细胞迁移的研究中得到探讨10中性粒细胞释放抗菌肽11黏液在感染中的作用9以及上皮细胞对过度损伤的反应12然而，一种可靠的囊性纤维化感染模型 体外 携带CF基因突变且暴露于空气（增加）的模型 生理状况）并整合免疫细胞的研究仍然缺乏。
为了弥补这一空白，我们描述了一种用于感染气道的稳定人源三维共培养的实验方案。该模型由人源囊性纤维化支气管上皮细胞和巨噬细胞组成，可感染铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），并能够同时模拟扩散屏障和免疫屏障。为了实现对抗感染药物进行合理高通量的测试，该共培养体系建立在培养板插入式小室的可渗透滤膜上，使用了两种人源细胞系：CFBE41o- 和由THP-1单核细胞衍生的巨噬细胞。此外，为了后续研究气溶胶化抗感染药物的沉积情况13，该模型建立于气液界面（ALI）条件下，而非液体覆盖条件（LCC）。
正如我们在此报道的，该模型不仅可用于评估细菌在抗生素处理后的存活情况，还可评估细胞毒性、上皮屏障完整性、巨噬细胞迁移以及炎症反应，这些均为药物开发的关键参数。
本方案结合了两种与肺部气道吸入治疗相关的细胞类型：巨噬细胞和囊性纤维化支气管上皮细胞。这些细胞被接种在可渗透支持性小室插入物的相对两侧，使细胞能够暴露于空气环境中（称为气液界面（ALI）条件）。该宿主细胞共培养体系随后被铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染。两种宿主细胞系均来源于人类：上皮细胞代表具有囊性纤维化跨膜电导调节因子通道突变的囊性纤维化支气管上皮（CFBE41o-），而THP-114细胞是一种特征明确的类巨噬细胞系。首先在培养板插入物的上层形成融合的上皮细胞层，然后将类巨噬细胞接种至相对的下室。一旦在气液界面条件下建立共培养体系，便在上皮顶端侧接种铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）。随后利用该感染性共培养系统评估抗生素（例如 妥布霉素）的疗效。分析以下终点指标：通过跨上皮电阻（TEER）评估上皮屏障完整性，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞间及细胞-细菌相互作用，通过菌落形成单位（CFU）计数评估细菌存活率，以及宿主细胞存活率（细胞毒性）和细胞因子释放水平。
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方案
1. 可渗透支持膜插件中细胞的生长与分化
- 培养 CFBE41o- 在含有10%胎牛血清（FCS）、1%非必需氨基酸和600 mg/L葡萄糖的13 mL最低必需培养基（MEM）中，于37 °C、5% CO₂条件下，在T75培养瓶中培养2 大气环境。每隔2–3天为细胞更换新鲜培养基。
- 当细胞融合度达到70%时，进行消化分离 在37°C条件下，用3 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）处理培养瓶15分钟 min。加入7 mL新鲜MEM，以300 x g 室温（RT）孵育4分钟。弃去上清液，加入10 mL新鲜MEM，同时通过轻柔吹打分散细胞团块。
- 使用自动细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数。以 2 x 10 的密度接种细胞5 细胞/孔，置于带可渗透支持膜的12孔板中（孔径3 μm，参见 材料表).
注意：自动细胞计数仪可测定细胞数量、细胞大小分布及细胞活力（参见 材料列表). 此处可使用孔径为0.4 μm的通透性支持膜；然而，在此条件下，应将巨噬细胞直接添加至顶端侧，此时无法评估其跨细胞迁移。 - 在可渗透支持物的顶端侧加入500 µL细胞悬液，基底侧加入1.5 mL新鲜培养基，以建立液-液界面条件（LLC）接种细胞。随后将细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养。2，72 小时。
- 为转入气液界面（ALI）培养，在接种后的第三天，先从基底外侧移除培养基，再从顶端移除。向基底外侧加入500 µL新鲜MEM培养基，每隔两天更换一次培养基，直至细胞形成融合的单层。
注意：本方案所用条件下，CFBE41o- 细胞通常在培养3-7天后达到汇合。 - 在第7天通过孵育CFBE41o评估上皮屏障特性- 细胞在37°C、5% CO₂条件下，顶端侧加入500 μL细胞培养基，基底侧加入1.5 mL细胞培养基，孵育1小时2.
- 通过STX2镊式电极和上皮细胞伏特-欧姆计测量跨上皮电阻（TEER）以评估屏障特性；培养7天后，TEER值高于300 Ω×cm²。
注意：最终，某些膜插件中的细胞 TEER 值较低。因此，应使用 TEER 值较高的可渗透插件 < 300 Ω×cm² 未被使用。
- 培养 THP-1 细胞时，将细胞接种于含 13 mL 添加 10% 胎牛血清（FCS）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基的 T75 培养瓶中，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养。2每两天传代一次细胞，接种量为 2 x 106 细胞/mL 细胞接种至新的 T75 培养瓶中。
注意：未分化的 THP-1 细胞以悬浮状态作为单核细胞培养。- 按如下步骤对 THP-1 细胞进行分化。将 T75 培养瓶中的内容物在 300 x g 孵育4分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于新鲜培养基中，并转移至新的T75培养瓶。加入10 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA），继续培养细胞 在37 °C、5% CO₂条件下，于RPMI中培养48小时2 大气15.
注意：使用PMA诱导分化后，细胞不再增殖，并贴附于培养瓶上。 - 为分离THP-1类巨噬细胞，先用37 °C磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，再加入3 mL细胞解离溶液（如 含0.5 mM EDTA的Accutase，在室温下作用10分钟。
- 在倒置显微镜下观察细胞，检查细胞是否脱落。加入 7 mL 新鲜培养基，以 300 x g 室温下孵育4分钟。
注意：巨噬细胞也可使用胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化20分钟进行消化。然而，与所选用的细胞解离溶液相比，胰蛋白酶对巨噬细胞的损伤更大（参见 材料表). - 去除上清液后，将巨噬细胞重悬于3 mL THP-1培养基中，转移至15 mL锥形管，按1.1.2节所述方法计数细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育，时间不超过1 h。2 在建立共培养之前。
注意：悬浮的 THP-1 细胞可用活率染料进行染色，以进一步成像共培养体系。在此步骤中，请使用以下程序（步骤 1.2.5）。 - 用10 µM的细胞活力染料对巨噬细胞进行染色（基于细胞内酯酶对乙酸基团的转化，参见 材料表) 其中将 3 µL 细胞活力染料加入细胞悬液中。37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 20 分钟2，然后用 37°C 的 PBS 洗涤 1 次以去除染料。
注意：以 300 x g 离心细胞以去除染料 g 室温（RT）下孵育4分钟。
- 按如下步骤对 THP-1 细胞进行分化。将 T75 培养瓶中的内容物在 300 x g 孵育4分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于新鲜培养基中，并转移至新的T75培养瓶。加入10 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA），继续培养细胞 在37 °C、5% CO₂条件下，于RPMI中培养48小时2 大气15.
2. 在可渗透支持物上建立上皮细胞-巨噬细胞共培养体系
- 使用TEER值≥300 Ω×cm²的CFBE41o-细胞单层（步骤1.1.6）。移除下室中的培养基，小心地将Transwell小室倒置放入无菌玻璃培养皿（50 mm × 200 mm）中，然后使用细胞刮刀去除穿过膜孔并在膜底侧过度生长的细胞。
注意：由于膜孔径为3 µm，上皮细胞容易穿过孔隙向基底侧生长，因此在基底侧接种巨噬细胞前必须将其清除。此时可对CFBE41o-肺上皮细胞进行染色，操作可参照步骤1.2.5，但无需使用细胞悬液，而是仅在可渗透支持膜上的贴壁细胞顶端侧加入MEM配制的染料溶液（500 µL）。 - 取PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞悬液，每孔加入2 × 105个细胞（溶于200 µL RPMI培养基中），接种于倒置Transwell小室的基底侧。
- 小心盖上培养皿，于37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
- 将Transwell小室重新放回12孔板中，并在可渗透支持膜的基底侧加入500 µL MEM培养基，以维持气液界面（ALI）培养条件。此时细胞已准备好用于感染实验。
3. 感染通过 P. aeruginosa
注意：从这一步开始的所有后续操作都必须在生物安全二级（BSL2）实验室中进行。
- 在50 mL锥形瓶中，加入15 mL含有300 μg/mL氨苄青霉素的溶菌肉汤（LB），并接种单个菌落 P. aeruginosa PAO1-GFP
注意：其他菌株 P. aeruginosa 也可在此使用，例如 PAO1 野生型、PA14 或临床菌株，需遵循各自的培养方案。 - 在37°C、180 rpm振荡条件下培养细菌18小时。
- 将18小时后的培养物转移至50 mL锥形管中，以3850 × g离心 g 5 分钟后弃去上清液，加入 10 mL 37°C 的无菌 PBS。
- 使用分光光度计在600 nm波长下测定光密度，并用细胞培养基调整细菌浓度，使其最终浓度为2 x 105 CFU/mL。这相当于每个上皮细胞感染一个细菌的感染复数（MOI）。
- 向可渗透支持物的顶端加入 100 μL 细菌悬液（步骤 2.4），并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 孵育1小时，以允许细菌附着于细胞。随后用移液器小心移除顶端液体，以恢复气液界面（ALI）条件。保留部分样本不进行感染，作为对照。
注意：此时应将附着的细菌接种于LB琼脂平板（见步骤5.4/5.5），以确定初始细菌接种量。 - 孵育目标药物 在细菌黏附细胞后，进行药物处理实验时，向顶端侧加入500 μL用细胞培养基稀释的药物溶液（本方案中使用6 μg/mL的妥布霉素），向基底侧加入1,500 µL不含药物的细胞培养基。
注意：除了将药物配制成溶液加入外，该模型也可调整为气溶胶沉积方式。在此情况下，将500 µL细胞培养基加入ALI模型的基底侧以维持细胞生长。药物首先通过雾化装置雾化，并借助适当的设备使其沉积于细胞顶侧腔室（相关设备此处不作描述）。感染并经药物处理的样本可按照第4–7节所述终点指标进行检测。从本步骤起，可使用可渗透支持膜进行成像（第4节）或检测细菌生长情况、哺乳动物细胞活力等指标（第5–7节）。
4. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）样品制备
- 共培养体系建立、感染及药物处理后，移除顶端和基底外侧的所有培养基，用37°C的PBS洗涤1次。 然后在室温下用3%多聚甲醛（PFA）固定细胞1小时（顶侧300 µL，底侧600 µL）。细胞核用5 µg/mL DAPI-PBS在室温下染色30分钟。
警告：PFA 具有危险性。 - 使用手术刀切割膜，并利用封片剂将膜置于两片12 mm显微镜盖玻片之间（参见 材料表在超净台中干燥30分钟，然后于4 °C保存。通过共聚焦扫描显微镜观察。
注意：共培养后、封片前可进行紧密连接免疫荧光染色。具体步骤为：细胞用3%多聚甲醛固定30分钟，PBS再次洗涤后，用含0.05%皂苷和1% BSA的PBS溶液进行通透处理。本实验中，使用小鼠抗人ZO-1抗体（1:400，4 °C过夜孵育）检测闭锁小带蛋白（zonula occludens protein, ZO-1）。随后，样品在室温下与Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG抗体（1:2000，红色荧光）孵育2小时。细胞核用DAPI（1 µg/mL）染色，最后将盖玻片用封片剂封片。 - 使用共聚焦显微镜对保存的膜进行成像。选择25倍或63倍水浸物镜，并采用405、488、505或633 nm激光进行检测。图像应具有1024分辨率 x 1024 像素分辨率。
注意：激光的选择取决于所使用的染料。 - 获取顶端和横截面视图，并使用zeta-stack模式（10–15层）通过成像软件构建三维模型。
5. 通过菌落形成单位（CFU）测量细菌增殖
- 收集顶端和基底外侧培养基（含细菌），以测定未贴附细菌的菌落形成单位（CFU）。从顶端和基底外侧分别收集 500 µL 并混合在一起。
注意：可直接使用该悬液进行细菌计数（步骤 5.4），或在 21,250 × g 条件下离心 10 分钟，取上清液检测乳酸脱氢酶（LDH）（第 6 节），和/或用 PBS 重悬 后计数胞外细菌（步骤 5.4）。 - 通过向可渗透支持物的每个腔室中加入 500 µL 无菌去离子冷水中，评估贴附和/或内化于细胞中的细菌存活情况。在室温下孵育细胞 30 分钟。
注意：样品可直接涂布于 LB 琼脂平板（见步骤 5.4），或整体插入板冷冻保存于 -20 °C，以备后续涂布使用。 - 若样品已冷冻，需在 37°C 下解冻 10 分钟，以测定贴壁/内化细菌的 CFU。使用每个孔专用的移液器吸头刮取膜表面，并反复吹打以去除所有贴附物质。
注意：此步骤中所有上皮细胞均已被裂解，贴壁/内化细菌以悬液形式释放，可用于涂布。 - 取两部分所得的细菌悬液，用含 0.05% Tween-80 的 PBS 进行 1/10 系列稀释，并将细菌涂布于 LB 琼脂平板上。
注意：建议稀释倍数在 1 至 10 之间。应在可观察到单个菌落的最高稀释度下进行细菌计数。 - 将琼脂平板在 30°C 下孵育 16–72 小时以计数菌落，并据此计算 CFU。
注意：平板孵育时采用 30°C 温度至关重要，适用于处理后的样品，并可观察到菌落生长延迟现象。
6. 通过乳酸脱氢酶检测评估细胞毒性
- 使用感染细胞的上清液（来自步骤 5.1）进行乳酸脱氢酶（LDH）检测，以评估细胞活力16。将上清液在 21,250 × g 条件下离心 10 分钟，使细菌及可能残留的细胞沉淀。取去除了细菌的上清液用于检测 LDH 释放量。
注意：在此检测中，上清液在测定 LDH 前不应冷冻。 - 将 100 µL 上清液转移至 96 孔板中，加入 100 µL LDH 检测试剂（参见材料表）。在避光条件下室温孵育 5 分钟，然后在 492 nm 处读取吸光度。
7. 评估人细胞因子的释放
- 对于细胞因子定量，可采用 ELISA 或流式微球阵列免疫测定法17（参见 材料表). 为此，将第 5.1 步的上清液在 21,250 x g 孵育10分钟，然后立即测定，或于-80 °C保存，最长可保存15天，之后进行分析。
- 使用市售ELISA试剂盒检测上清液。
注意：该操作步骤遵循制造商说明书，包括使用捕获抗体包被酶标板，加入样本（100 µL）和细胞因子标准品，孵育，洗涤，再加入检测抗体，以实现对细胞因子存在的比色法检测。 或者，可使用市售试剂盒通过流式细胞术检测细胞因子（参见 材料表).
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结果
图1A 显示了人支气管上皮细胞与巨噬细胞在可渗透支持物的顶端和基底侧分别培养24小时后共培养体系的形态。上皮屏障完整性通过较高的跨上皮电阻（TEER，834 Ω×cm2）以及通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光染色得以证实（图1B）。在未感染的CFBE41o- 单层培养中观察到的屏障完整性结果，在未感染的上皮细胞-巨噬细胞共培养体系中同样可见。
为建立细菌感染模型，将P. aeruginosa以感染复数（MOI）1:1接种于CFBE41o-细胞。感染后6小时（图2A），在共培养体系的顶端侧观察到巨噬细胞。感染后，跨上皮电阻（TEER）从834下降至250 Ω×cm2，表明上皮屏障功能受损，ZO-1染色结果也直观显示了这一现象（...
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讨论
本文描述了一种感染气道三维共培养体系的实验方案，该体系由人囊性纤维化支气管上皮细胞系 CFBE41o- 和人单核细胞来源的巨噬细胞系 THP-1 构成。该方案可用于同时评估上皮屏障完整性、巨噬细胞跨膜迁移、细菌存活以及炎症反应，这些参数在同步检测药物疗效和宿主反应时具有重要意义。该模型的创新之处在于将上皮细胞（即 人囊性纤维化细胞系和巨噬细胞）与急性细菌感染（即 P. aeruginosa）相结合。实验表明，上皮细胞中的急性感染可通过抗生素（即 妥布霉素）加以控制。除了使用人囊性纤维化细胞系外，整个模型均在气液界面（ALI）条件下建立，更接近囊性纤维化生理状态。采用囊性纤维化细胞系使模型具备了部分疾病特征。囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变直接导致肺部上皮液体转运失调。此外，CF 基因的突变（如 ΔF508）会导致黏液增稠，并在 P. aeruginosa4 感染后引发炎症及严重的肺损伤。CFTR 功能障碍引起的这些病理表现可能涉及自噬功能受损，而自噬障碍是一种与囊性纤维化肺部疾病发病机制相关的重要细胞机制
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了欧盟“地平线2020”研究、技术发展与示范计划的资助，项目编号为642028 H2020-MSCA-ITN-2014，NABBA——设计与开发先进纳米药物以克服生物屏障并治疗严重疾病。我们感谢Ana Costa博士和Jenny Juntke博士在共培养体系开发过程中提供的大力支持，感谢Olga Hartwig提供科学插图，Anja Honecker提供ELISA检测支持，Petra König、Jana Westhues以及Chiara De Rossi博士在细胞培养、分析和显微镜技术方面的协助。我们还感谢Chelsea Thorn对本文稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accutase | Accutase | AT104 | |
| 氨苄青霉素 | Carl Roth，德国 | HP62.1 | |
| CASY TT 细胞计数仪与分析仪 | OLS Omni Life Sciences | - | |
| CellTrace 远红染料 | Thermo Fischer | C34564 | |
| Universal 320R 离心机 | Hettich，德国 | 1406 | |
| CFBE41o- 细胞 | 1. Gruenert 细胞系分发项目 2. Sigma-Aldrich | 1. Dieter C. Gruenert 博士惠赠 2. SCC151 | |
| EVOM2 用筷子式电极组，4 mm | World Precision Instruments，Sarasota，美国 | STX2 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 CLSM | Leica，Mannheim，德国 | TCS SP 8 | |
| 细胞因子 ELISA Ready-SET-Go 试剂盒 | Affymetrix eBioscience，美国 | 15541037 | |
| 细胞因子 Panel I 和 Panel II | LEGENDplex 免疫检测试剂（Biolegend，美国） | 740102 | |
| 细胞毒性检测试剂盒（LDH） | Roche | 11644793001 | |
| D-(+) 葡萄糖 | Merck | 47829 | |
| Dako 荧光封片剂 | DAKO | S3023 | |
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚） | Thermo Fischer | D1306 | |
| 上皮细胞伏特计 | World Precision Instruments，Sarasota，美国 | EVOM2 | |
| Falcon 12 孔板用可渗透支持膜，带 3.0μm 透明 PET 膜，无菌 | Corning，阿姆斯特丹，荷兰 | 353181 | |
| 胎牛血清 | Lonza，巴塞尔，瑞士 | DE14-801F | |
| 山羊抗小鼠（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 633 标记 | Invitrogen | A-21050 | |
| L-乳酸脱氢酶（LDH），兔骨骼肌来源 | Roche，Mannheim，德国 | 10127230001 | |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich，德国 | L2897-1KG | |
| MEM（最低必需培养基） | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11095072 | |
| 非必需氨基酸溶液（100X） | Gibco Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140050 | |
| 铜绿假单胞菌 PAO1 菌株 | 美国典型培养物保藏中心 | 47085 | |
| 铜绿假单胞菌 PAO1-GFP 菌株 | 美国典型培养物保藏中心 | 10145GFP | |
| 多聚甲醛水溶液 -16% | EMS DIASUM | 15710-S | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fischer | 10010023 | |
| 培养皿 | Greiner | 664102 | |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） | Sigma，德国 | P8139-1MG | |
| 精密盖玻片 | ThorLabs | CG15KH | |
| 纯化小鼠抗人 ZO-1 IgG 抗体 | BD Transduction Laboratories | 610966 | |
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640 培养基 | Gibco by Lifetechnologies，Paisley，英国 | 11875093 | |
| 钠钙玻璃培养皿，50 × 200 mm（高度 × 外径） | Normax，葡萄牙 | 5058561 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich，德国 | S4521 | |
| T75 培养瓶 | Thermo Fischer | 156499 | |
| THP-1 细胞 | 德国微生物与细胞培养保藏中心（DSMZ；Braunschweig，德国） | 编号 ACC-16 | |
| 硫酸妥布霉素盐 | Sigma | T1783-500MG | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fischer | 25300054 | |
| Tween80 | Sigma-Aldrich，德国 | P1754 |
参考文献
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