Summary
Планарная подвижность используется для оценки стимуляторов и свойств вывода натуральных продуктов по сравнению с движением животных только в родниковой воде.
Abstract
Простое, управляемое средство использования неаразитарных planarian, Dugesia tigrina, свободно живущих водных плоских червей, для изучения стимуляторов и вывода свойства натуральных продуктов описывается. Экспериментальные анализы, пользующиеся уникальными аспектами планарной физиологии, были применены к исследованиям по заживлению ран, регенерации и опухолевому анализу. Кроме того, поскольку планарианцы проявляют чувствительность к различным экологическим стимулам и способны изучать и развивать условные реакции, они могут быть использованы в поведенческих исследованиях изучения обучения и памяти. Планарианцы обладают базовой двусторонней симметрией и центральной нервной системой, которая использует нейромедиаторные системы, податливые к исследованиям, исследуя эффекты нейромышечных биомодуляторов. Следовательно, были разработаны экспериментальные системы мониторинга планарного движения и подвижности для изучения наркомании и вывода средств. Поскольку планарная подвижность открывает потенциал для чувствительной, легко стандартизированной системы анализа подвижности для мониторинга влияния стимулов, тест planarian locomotor velocity (pLmV) был адаптирован для мониторинга как стимуляции, так и поведения вывода планарами путем определения количества линий сетки, пересекаемых животными со временем. Здесь демонстрируется и объясняется техника и ее применение.
Introduction
В описанном протоколе используется планарная подвижность для оценки биомодулирующего воздействия природных веществ. Он был специально адаптирован, чтобы определить, если эти вещества функционируют как стимуляторы, и если они затем были связаны с измеримым поведениемвывода 1. Этот анализ, известный как планарный тест скорости локомотива (pLmV), был впервые использован для тестирования известных фармакологическихагентов 2,3. Применение этого планарного анализа на основе подвижности с тех пор выросло в популярности и было принято различными лабораториями, заинтересованными в веществах, кроменатуральных продуктов 4,,5. Для этого анализа, планарианец помещается в чашку Петри, содержащую родниковую воду или родниковую воду, содержащую растворенный биомодулятор. Поскольку само блюдо помещается на графовую бумагу, количество линий сетки, пересекаемых животным со временем, когда оно перемещается по контейнеру, может быть использовано для определения скорости движения в каждом состоянии. Свет / темный тест, в противном случае называют условным тестом предпочтения места (CPP), является еще одним изменением на тему мониторинга планарной подвижности, и оценивает, как быстро животные реагируют и мигрируют в затемненнуюсреду 6,7. Видео слежение за планарными движениями также может быть проанализировано с помощью компьютерных программ и центра массы (COM)слежения 8,,9,,10,,11.
Использование planarian в качестве модели животных для таких исследований предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими животными в том, что экспериментатор может легко контролировать анализ окружающей среды. В частности, голодающие планарианцы перед экспериментами могут предотвратить их воздействие на другие питательные или фармакологические агенты, которые в противном случае могли бы запутать результаты, и конкретный биомодулятор, на который ведется расследование, может быть представлен планарианам, просто добавив его непосредственно в культурную воду, тем самым стандартизируя воздействие. Так как планарианцы имеют нервную систему и нейротрансмиттеров, которые напоминают "высшего порядка" животных, физиологии и экспериментальной реакции этих животных на нервно-мышечные стимулы считаются биологическиактуальными для других организмов 12,13,14,15,16. Кроме того, поскольку планарианцы относительно недороги и просты в обслуживании в лаборатории, они предлагают доступную биологическую модель для многих исследователей.
Как экспериментальное животное, планарианцы подходят для широкого спектра исследований. Например, наша группа, а также другие исследователи используют планариев для изучения опухолевых17,,18,,19. Планарианцы также демонстрируют множество ответных действий на химические, тепловые, гравитационные, электрические, фото- и магнитные стимулы, которые легли в основу других систем анализа. Некоторые из этих эффектов были использованы для изучения обучения ипамяти у этих животных 20,21,22,23,24,25,26,27. Основное использование планарной модели в литературе в настоящее время фокусируется на активности планарных плюрипотентных стволовых клеток, называемых необластами, иих роли в регенерации 28,,29,,30. Таким образом, принятие описанной здесь модели позволяет продолжить изучение с использованием других планарных анализов, чтобы обеспечить более широкое понимание того, как натуральные продукты и другие биомодуляторы влияют на организм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Планарное мужство
- Используйте planarians закупленные от биологической компании поставкы или одичал-уловлено if needed. Планарианцы, используемые в этом протоколе Dugesia tigrina, как у перечислены в списке поставок. Этот вид также называют Girardia tigrina31. Другие водные planarian видов также приемлемы2,3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол ориентирован на животных, приобретенных у биологической компании-снабжения. Эта система анализа не была протестирована с дикими поймали planarians. Однако, если дикие пойманные планарии используются, рекомендуется, чтобы они привыкли к воде, используемой в экспериментах, а также лабораторной среде, по крайней мере за 1 неделю до использования. - По прибытии, передача planarians пластиковых контейнеров для хранения продуктов питания, содержащих чистую родниковую воду и держать крышки приоткрытой.
- Поддерживайте планариев в затемненной среде.
- Кормите недавно поставленных planarians после 24-36 ч в их новой среде.
- Разрешить планариам акклиматизироваться в лаборатории по крайней мере за 1 неделю до экспериментов.
- Кормите планировщиков по регулярному расписанию два раза в неделю.
- Разрешить planarians кормить ad libitum на нарезанные органические вареные яйца или смешанной органической печени говядины в течение 1-2 ч.
- Поместите кормили planarians в чистый контейнер после кормления.
- Удалите загрязненную воду с планариев.
- Используйте небольшую плоскую акварею кисть (номер 3-6) для передачи пищевого мусора и слизи, прилипающих к контейнеру со всего planarians на бумажное полотенце.
- С пресной родниковой водой и нежным закрученным или волнением, выбить planarians и залить их в чистый контейнер.
- Любые планарианцы, оставшиеся в контейнере, могут быть переданы с помощью круглой акварелиной кисти (номер 3-6) или передачи пипетки с широким отверстием.
- Декант трансферной воды.
- Обложка planarians с чистой родниковой водой.
- После 24 ч, удалить planarians из любых изгнанных пищевых отходов, передавая их в чистый контейнер, как описано выше (шаги 1.6.2.1-1.6.2.6).
- Для очистки контейнеров и посуды, используемых для планарного мужа, не используйте мыло или моющее средство. Очистите эти предметы, очистив их хорошо с чистой водой (водопроводная вода является приемлемым) и сушки их с чистой тканью или бумажным полотенцем.
2. Подготовка планариев к экспериментам
- Разрешить вновь доставлены planarians акклиматизироваться к окружающей среде по крайней мере за 1 неделю до экспериментов.
- Голодают планарианцы в течение 5-10 дней до экспериментов.
- Изменение культуры воды по крайней мере 1x в период голодания.
3. Планарная скорость локомотива (pLmV) тест: Стимулирующее поведение
- Перед экспериментами убедитесь, что голодающие планарианцы полностью сформированы, с полной и пигментированной головой и хвостом.
- Подготовка стекла или пластика 10 см Петри блюдо и контейнер для привыкания для теста pLmV до начала эксперимента.
- Поместите чистую чашку Петри диаметром 10 см, которая будет использоваться для теста pLmV на предварительной сетке бумаги (с 0,5 см квадратов).
- Добавьте 20 мл чистейщей родниковой воды для контроля, или родниковую воду, содержащую соответствующую концентрацию тестируемого природного продукта, к чашке Петри диаметром 10 см, которая будет использоваться для теста PLmV.
- Распоитите камеру (например, сотовый телефон или камеру высокого разрешения) над подготовленной чашкой Петри диаметром 10 см для записи планарной подвижности над сетчатой бумагой во время эксперимента. Кольцо стенд удобный способ распоить камеру на расстоянии, которое может записывать весь вид 10 см Петри блюдо и сетки линий.
- Подготовьте контейнер для привыкания с 5-10 мл чистейщей родниковой воды (контроля) или родниковой воды, содержащей соответствующую концентрацию тестированного природного продукта. Подходит контейнер, похожий на сцинтилляционный флакон или небольшую чашку Петри длиной 5 см.
- Используйте небольшую, чистую, плоскую или круглую акварельную кисть, чтобы аккуратно перенести планарную из контейнера с родниковой водой в контейнер для привыкания, содержащий 5-10 мл чистой родниковой воды или родниковой воды, содержащей натуральный продукт, который проходит испытания.
ПРИМЕЧАНИЕ: При манипулировании планарными для анализа pLmV используйте небольшую, чистую, плоскую или круглую акварельную кисть (номер 3-6). При перемещении планарных, кисть должна быть помещена под животное, чтобы поднять его осторожно. Чтобы планарианцы не пострадали при использовании кисти, щетина кисти не должна быть splayed под животным. Распространение из щетины может нанести вред планарианской, если он оказался между волокнами кисти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Широкий родила передачи пипетки также могут быть использованы для передачи planarian в чистый и сухой контейнер для жилья.- При использовании пипетки, удалить избыток воды переехал с planarian из контейнера привыкания с помощью передачи пипетки.
- Аккуратно добавьте раствор привыкания (т.е. родниковую воду для контроля или родниковую воду, содержащую концентрацию тестуемого природного продукта) в контейнер для привыкания, содержащий планар.
- Периоды привыкания будут зависеть от динамики стимуляции, оцениваемой для тестируют натуральный продукт. Время привыкания 2 мин оказалось приемлемым для обнаружения стимуляции в этой работе1.
- После 2 мин периода привыкания используйте акварельную кисть, чтобы аккуратно перенести планарную в центр подготовленной 10-сантиметровой чашки Петри для эксперимента по стимуляции pLmV.
- Запустите камеру, чтобы записать движение плана. Запись 10-11 мин видео.
- Подготовь контейнер для привыкания и 10-сантиметровую чашку Петри для эксперимента pLmV со свежими растворами для каждого плана.
- Используйте специальные пипетки, посуду, контейнеры и кисти для каждой экспериментальной концентрации натурального продукта, тестируются, чтобы избежать непреднамеренного подвергая planarians к неправильному решению во время экспериментов.
- Поскольку планарианцы проявляют изученное поведение, каждый планарианец (контроль или тест) должен использоваться толькоодин раз 21,22.
4. Планарная скорость локомотива (pLmV) тест: Поведение вывода
- Перед экспериментами убедитесь, что голодающие планарианцы полностью сформированы, с полной и пигментированной головой и хвостом.
- Подготовка 10 см Петри блюдо (стекло или пластик) для эксперимента pLmV, 5 см Петри блюдо (стекло или пластик) для полоскания planarian после привыкания, и привыкание контейнер до начала эксперимента.
- Поместите чистую чашку Петри диаметром 10 см, которая будет использоваться для эксперимента pLmV на преобладаемой сетке бумаги с 0,5 см квадратов).
- Добавьте 20 мл чистейной родниковой воды в чашку Петри диаметром 10 см, которая будет использоваться для эксперимента pLmV.
- Распоитите камеру над подготовленной чашкой Петри диаметром 10 см, как в шаге 3.2.3, чтобы зафиксировать планарную подвижность над сетчатой бумагой во время эксперимента.
- Подготовьте планарианский контейнер для полоскания, добавив только 5 мл родниковой воды в чашку Петри длиной 5 см.
- Подготовьте контейнер для привыкания с 5-10 мл чистейщей родниковой воды (контроля) или родниковой воды, содержащей натуральный продукт, который проходит испытания. Подходит контейнер, похожий на сцинтилляционный флакон или небольшую 5-сантиметровую чашку Петри (стеклянную или пластиковую).
- Используйте небольшую, чистую, плоскую или круглую акварельную кисть для переноса планарной из родниковой воды в подготовленный контейнер для привыкания, содержащий 5-10 мл чистейщей родниковой воды (контроля) или родниковой воды, содержащей натуральный продукт, который проходит испытания. Аккуратно переместите животное из контейнера для складов в контейнер для привыкания. Убедитесь, что планарий не поврежден кистью.
ПРИМЕЧАНИЕ: При манипулировании планарными для анализа pLmV используйте небольшую, чистую, плоскую или круглую акварельную кисть (номер 3-6). При перемещении планарных, кисть должна быть помещена под животное, чтобы поднять его осторожно. Чтобы планарианцы не пострадали при использовании кисти, щетина кисти не должна быть splayed под животным. Распространение из щетины может нанести вред планарианской, если он оказался между волокнами кисти.
ПРИМЕЧАНИЕ: Широкий родила передачи пипетки также могут быть использованы для передачи planarian в чистый и сухой контейнер привыкания.- При использовании пипетки, избыток воды переехал с planarian должны быть удалены из контейнера привыкания с помощью передачи пипетки.
- Аккуратно добавьте раствор привыкания (т.е. чистую родниковую воду для контроля или родниковую воду, содержащую тестируется натуральный продукт) в контейнер для привыкания, содержащий планар.
- Периоды привыкания к изъятию будут зависеть от динамики стимуляции, оцениваемой для тестируются на натуральный продукт; 2-5 мин оказались достаточными.
- После периода привыкания используйте акварелию кисть, чтобы аккуратно перенести планарную в подготовленную 5-сантиметровую чашку Петри, содержащую родниковую воду, чтобы смыть любой натуральный продукт из контейнера для привыкания. Убедитесь, что планарий не поврежден кистью.
- Немедленно перенесите планар в центр подготовленной 10-сантиметровой чашки Петри, содержащей родниковую воду для эксперимента по выводу PLmV. Убедитесь, что планарий не поврежден кистью.
- Запустите камеру, чтобы записать движение плана. Запись 10-11 мин видео.
- Подготовьте контейнер для привыкания, контейнер для полоскания и 10-сантиметровую чашку Петри для эксперимента pLmV со свежими растворами для каждого плана.
- Используйте специальные пипетки, посуду, контейнеры и кисти для каждой экспериментальной концентрации натурального продукта, тестируются, чтобы избежать непреднамеренного подвергая planarians к неправильному решению во время экспериментов.
- Потому что planarians exhibit выученное поведение, используйте каждое planarian (контроль или испытание)только раз 26,27.
5. Анализ данных
- Подготовь таблицу сбора данных для документирования поведения и подвижности планариев по мере пересечения количества линий сетки за каждую минуту во время запуска pLmV. Таблица должна позволить задокументировать также накопленное количество строк в минуту, пересекаемое планарианом. Включите строки для заметок и таблицу определений, чтобы подсчитать наблюдение за поведением в течение экспериментального периода, такие как «блуждание» и «остановка» (см. Обсуждение).
- Используя видео, подсчитайте количество полных линий сетки, пересекаемых planarian в минуту в течение 10 минут, и замечите это число в таблице данных. Типичное планарное поведение состоит из непрерывной скорости, направленного вперед, горизонтального движения, с периодическими поворотами и без остановок.
- Начните приукрашивать эксперимент в тот момент, когда планарианка отошла от кисти, используемой для передачи ее в 10-сантиметровую чашку Петри. Завехай это время старта.
- Чтобы определить, когда животное пересекает полный квадрат сетки, сосредоточьтесь на голове и оценка одной линии, когда голова полностью пересекает квадрат.
- Чтобы выбить полную сетку, когда червь перемещается по краю блюда, визуализировать расстояние 0,5 см, ссылаясь на линии, как они простираются от края блюда. Если планарианец пересекает угол коробки, обратитесь ко второй линии пересекли забить одну линию сетки. Опять же, сосредоточиться на голове, чтобы сделать эти определения.
- Остановите видео после каждой минуты, чтобы записать данные.
- При перезапуске видео, чтобы подсчитать в следующую минуту, если голова червя была между линиями сетки, когда видео было остановлено, заведать первую строку перешли как полный ящик.
- Оценка количество линий сетки пересекли в течение 10 минут.
- Если животное перестает двигаться во время теста pLmV и больше не пересекает линии сетки в течение 10 минут времени записи, документируйте поведение планарианского в поведенческой диаграмме (например, 'wander' или 'stop'). Вместо этого следует принимать к сведению животных, которые прекращают свою перемотку вперед во время анализа PLmV, и данные, представленные в качестве частоты общего числа животных, подвергшихся воздействию этой концентрации реагентов. Спиральное или судорожное поведение (известное как поведение C), предотвращая любое движение вперед в период привыкания, указывает на то, что концентрация натурального продукта не подходит для использования в анализе pLmV, потому что анализ pLmV основан на подвижности. Поведение C-типа может быть проанализировано с помощью другого типа анализа (см. Обсуждение).
- Если возможно, проверьте несколько экспериментальных концентраций природного продукта с использованием по крайней мере 9-12 червей в разные дни и разное время суток, если определить общее влияние реагента на планарную физиологию. Однако, если исследователи стремятся уменьшить циркадную ритм-индуцированной изменчивости, эксперименты могут быть проведены с постоянным освещением в установленное время суток с использованием червей, которые культурируются с приутупляется свет / темные циклы и установить время кормления. Иметь по крайней мере двух экспериментаторов, участвующих в проекте, чтобы позволить возможность иметь один отдельный данный записи, в то время как второй человек подсчитывает линии сетки "слепой" к условиям, используемым для сбора данных. Участие различных лиц в сборе данных, а также статистических расчетах и анализе также уменьшает возможную предвзятость.
- Рассчитайте линию сетки для каждого естественного продукта концентрации на каждый день по отношению к контрольу рассчитывает на каждую минуту, так что данные из разных дней, времени и экспериментаторов могут быть объединены. Эти данные можно усредить, а затем проанализировать с помощью T-тестов студента. P-значения для каждого теста могут быть оценены в минуту по сравнению с контролем и между концентрациями реагентов. Оценки ANOVA с использованием наборов данных, полученных на основе различных экспериментальных концентраций, являются еще одним методом анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лаборатория, созданная и подготовка рабочего пространства для проведения анализа pLmV, должна быть завершена до начала экспериментов. Это включает в себя подготовку контейнера для привыкания, промыть контейнер, если это необходимо (для вывода экспериментов), Петри блюдо над ламинированной сетки бумаги, и правильно размещены камеры (Рисунок 1). После того, как все видео приняты, желательно использовать общий лист данных для стандартизации сбора данных и представления между следователями(рисунок 2 и рисунок 2 Дополнение).
Камера, установленная должна позволить четкое представление о планарной и сетки бумаги, чтобы точную оценку прогресса животного в течение всего эксперимента(рисунок 3A и рисунок 3A дополнения). Сбор данных должен включать количество пересекаемых линий сетки, а также общее общее количество линий, пересекаемых в минуту эксперимента(рисунок 3B). Во время анализа pLmV, planarians имеют непрерывную скорость, направленное вперед, горизонтальное движение, с периодическими поворотами, и не останавливаются. При начале, первый полный ящик сетки пересек должны быть забиты как один, а не первая строка, как определено в примере видео. Важно записать время начала направленного движения после того, как планарианец свободен от кисти, используемой для передачи его в блюдо pLmV, а затем следовать до конца в течение каждой минуты после этого. Если планарианец является частью пути через окно в минутное время, следующая линия сетки, пересекаемая после перезапуска видео, должна быть засчитана как полная коробка. Когда животное перемещается по краю блюда, обратитесь к линиям, как они простираются от блюда, чтобы определить расстояние 0,5 см. Когда черви сталкиваются с углу коробки, обратитесь к второй линии пересекли забить одну линию сетки. Всегда сосредоточьтесь на голове, чтобы сделать эти определения. Если планарианец начинает покрывать плотную область, экспериментатор должен снова следовать за головой червя, чтобы контролировать расстояние полной сетки коробки. Пример такого поведения включен в дополнительное видео (рисунок3A дополнения).
Чтобы стандартизировать результаты каждого исследования, pLmV работает должны быть рассчитаны и построены как количество ящиков пересекли по отношению к прогрессу соответствия управления червя (Рисунок 3B). Каждый пользователь должен быть обучен для выполнения анализа и подсчета линий сетки до начала испытаний с использованием реагентов, представляющих интерес. В качестве эталона, используя экспериментальную настройку, планарианцы в родниковой воде обычно покрывают примерно 24 коробки за 3 минуты(рисунок 4A;данные от 4 пользователей, в среднем 24,8 ± 4,8). Следует изучить диапазон концентраций испытательных реагентов для определения типа поведенческого анализа, который будет использоваться для каждого из них. Для анализа pLmV, исследователи должны определить, если животные проявляют подвижность при воздействии (Рисунок 4B). Другие типы поведенческого анализа могут быть более эффективными для различных типов поведения (см. обсуждение). По сравнению с контролем родниковой воды, стимулирующие данные будут показывать все большее число линий сетки пересекли, как животное движется через контейнер pLmV с желаемой концентрацией испытательного реагента в родниковой воде, после привыкания в той же концентрации испытательного реагента. В отличие от этого, данные об изъятии покажет уменьшение числа линий сетки пересекли, по отношению к контролю родниковой воды, когда planarian движется через контейнер pLmV, имеющих родниковую воду в одиночку, после того, как привыкли в желаемой концентрации реагента, смешанного в родниковойводе (рисунок 4C и 4D). Примечательно, что данные о сверхготовом выводе могут привести к тому, что количество сетки будет меньше, чем у элементов управления, как это наблюдалось в данных о выводе наркотиковдругими группами 2,,6.
Спринг-контроль воды planarians будет двигаться по линии сетки в течение всего эксперимента. Однако во время анализа планарианцы-испытатели могут прекратить пересечение линий электропередачи. Если это происходит, эти данные должны быть выделены отдельно от данных о червях, сохраняя их прогресс в течение линий сетки. Документирование этих данных в процентах от общего числа животных, подвергшихся воздействию этой конкретной концентрации реагентов, является эффективным способом проиллюстрировать относительную частоту этих выводов(рисунок 5A-C, рисунок 5A дополнение и рисунок 5B дополнения). Поведение, не препятствуя планариам пересекать линии сетки, должно быть включено в анализ pLmV, даже если эти движения препятствуют устойчивому прогрессу животных.
Рисунок 1: Установка представителя для анализа pLmV.
Лабораторное пространство должно быть подготовлено до начала анализа. Показана типичная установка с 10-сантиметровой чашкой Петри, помещенной на ламинированную 0,5 см сетчатую бумагу. Камера документа расположена таким образом, что четкое представление о 10 см чашки Петри может быть записано на связанном компьютере. Тем не менее, любая камера может быть использована для записи прогресса planarians во время эксперимента, включая камеру сотового телефона, расположенную над чашкой Петри с помощью кольцевой подготовки. На заднем плане находится 5-сантиметровая чашка Петри для полоскания червей для экспериментов по выводу, а также небольшие белые контейнеры, используемые для привыкания планариев. Кроме того, на заднем плане помечены, посвященный круглые акварели кисти, пипетки, и Петри блюда для каждого продукта концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: лист данных pLmV.
Подготовленный лист данных для записи количества пересекаемых линий сетки, соответствующий относительно контрольных данных, а также средство подсчета любого поведения полезно для целей сбора данных. Смотрите рисунок 2 Дополнение для загружаемой версии PDF этой цифры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель pLmV эксперимент и лист данных.
(A) Камера должна быть помещена над 10 см Петри блюдо, используемое для анализа pLmV так, что планарианец и полный 0,5 см сетки под блюдо хорошо видны. Полный запуск pLmV должен быть записан(рисунок 3A дополнение), и ( B )количество линийсетки пересекли каждую минуту помещается в подготовленную таблицу данных. Накопленные общие линии сетки пересекаются должны быть подсчитаны, а затем они должны быть преобразованы в количество накопленных линий пересекли по отношению к соответствующим весной воды управления червя. Предоставленные данные в таблице рисунков(B)соответствует подсчетам с помощью дополнительного видео(рисунок 3A дополнения). Соответствующие подсчеты элементов управления не отображаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные графики данных о стимуляторах и выводах.
Исследователи должны быть обучены использовать и оценка PLmV анализ сетки линий с использованием родниковой воды только до экспериментов. Как правило, planarians путешествия около 25 линий сетки в 3 мин.(A ) Данные от четырех пользователей показано, каждый с 10 родникового контроля воды червей. Чтобы оценить влияние реагента на планарную подвижность, с помощью анализа pLmV проводится обследование ряда концентраций, и общее количество пересекаемых линий сетки рассматривается по сравнению с соответствующими контрольными отсчетами в 3 минуты. (B)Данные управления представлены белым баром. Тестовые данные представлены черными полосами, с концентрациями, используемыми в mM. По отношению к контрольу данные должны быть построены, чтобы наилучшим образом представлять собранные данные. (C) Стимулирующие данные, представленные синей линией/бриллиантами, покажут рост пересекаемых линий сетки по сравнению сданными о выводесредств ( D), также представленными синей линией/бриллиантами, - покажут уменьшение наклона от начального начального значения по отношению к данным управления, как показано на красной линии/квадратах вобоих (C и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Наблюдение и документация поведенческих данных.
Планарианцы в pLmV анализ, которые не поддерживают направленное движение во время эксперимента, но остановить с характерным поведением и больше не двигаться по сеткам должны быть подсчитаны. Типичное поведение может включать в себя дисплеи, как "блуждать"(A и рисунок 5A дополнение), и "стоп"(B и рисунок 5B дополнение). Эти подсчеты поведенческих данных должны быть представлены для документирования частоты такого поведения по сравнению со всеми животными, подвергшимися воздействию этой концентрации продукта (C). Показаны выборочных данных, документирования процентов родникового контроля воды животных (Ci), и животных, подверженных стимулятор (Cii), имеющих блуждать (синий), остановить (красный) или нет (зеленый) поведение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Простой и доступный планарный анализ подвижности описывается для определения стимулирующих и абстиненции эффектов натуральных продуктов. В качестве поведенческой модели необходимо иметь строгие протоколы для скоринга движения и четкие определения любого поведения для стандартизации наблюдений между различными экспериментаторами. Представленные идеи дают представление о том, как этого можно достичь. Каждая лаборатория, используя этот протокол, должна адаптировать представленную информацию в соответствии с эффектами конкретного продукта, тестируются. Рекомендуется тщательно настроить рабочее пространство, чтобы гарантировать, что тесты могут быть сделаны в последовательных условиях каждым исследователем, участвующим в исследовании(рисунок 1). Стандартизированные листы записей могут быть составлены, чтобы помочь с точным ведением записей и сбором данных о подвижности иповедении (рисунок 2 и рисунок 3B).
Испытания подвижности должны быть сделаны в разное время суток, используя различные партии planarians, если это возможно, для учета расхождений присущих циркадной деятельности. Хотя эти анализы не были проведены, предполагается, что исследователи контролировать, как планарианский циркадный ритм может повлиять на подвижность путем поддержания planarians с помощью стандартного света / темного цикла (например, 12/12), и при проведении анализа pLmV, использовать стандартные условия освещения и запустить тесты в то жевремя день 32,33,34. Исследователи должны практиковать механику анализа pLmV и научиться считать линии сетки, чтобы стандартизировать как обработку планариев, так и оценку планарной подвижности(рисунок 3). Это должно быть сделано с использованием чистейодного контроля родниковой воды. Как правило, после 10–20 запусков такой практики данные становятся вполне стандартными для всех членов лаборатории. Считается после набора pLmV время должно быть выбрано для сравнения прогресса в изучении анализа. Следователи обычно наблюдают около 24 линий сетки пересекли 3 мин в PLmV анализ в родниковой воде после 2 мин привыкание в родниковой воде(рисунок 4A; репрезентативные данные для четырех исследователей с 10 случайных контроля родниковой воды каждый; 24,8 ± 4,8 линии сетки). Наличие двух или трех обученных исследователей, проводящих каждый набор тестов, может еще больше повысить надежность результатов, поскольку при анализе ошибок могут быть учтены любые специфические для пользователя последствия для метода и подсчеты. Таким образом, тесты и подсчеты могут быть заменены между следователями, так что количество может быть сделано "слепой" к экспериментальным условиям. Чтобы уменьшить вероятность предвзятости, различные лица могли бы проводить статистические тесты на данные подсчета и выполнять последующие анализы. Вне присутствия тестируются, следует избегать экологических изменений в качестве воды, таких как температура и рН. Поскольку планарии светочувствительны, установка эксперимента должна гарантировать, что освещение рабочего пространства является оверно. Наконец, поскольку планарианцы могут проявлять изученное поведение, каждый червь, включая элементы управления, должен использоватьсятолько один раз 26,27.
Полезно иметь экспериментальный контрольный список в лаборатории, если несколько экспериментаторов работают с анализом, особенно в исследовательской лаборатории бакалавриата, чтобы избежать распространенных ловушек, которые могут возникнуть при запуске теста pLmV, что повлияет на статистическую ценность результатов. Все решения должны быть при комнатной температуре, потому что планарная подвижность снижается при более низких температурах. Следует позаботиться о том, чтобы образцы голодали за 5-10 дней до их использования и чтобы каждый образец был полностью сформирован, с полностью пигментированной головой и хвостом. Предлагается также использовать выделенные плоские или круглые акваренные кисти (число 3-6), контейнеры для привыкания и блюда Петри для каждой экспериментальной концентрации, чтобы сделать рабочий процесс более плавным для экспериментатора. Техника передачи planarians с использованием небольших плоских или круглых акварели кисти должны широко практикуется следователями для обеспечения эффективной передачи червей между контейнерами, не причиняя вреда или бедствия для животных (см. обсуждение выше; Рисунок 4A). Использование этих кистей сводит к минимуму передачу жидкостей между контейнерами и снижает потенциальную нагрузку на планариев. Тем не менее, planarians могут быть повреждены щетиной, если волокна распространяются или splayed, когда они контакт с животным.
Поскольку анализ pLmV опирается на поведенческие данные, важно использовать достаточно большой набор данных для обеспечения надежных данных, несмотря на врожденную изменчивость реакции червя к червю. Таким образом, большинство лабораторий используют как минимум девять-двенадцать планариев для проверки каждой концентрации исследованного продукта, особенно потому, что натуральные продукты могут не иметь столь заметногоэффекта, как стандартные фармацевтические препараты 1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,13,,14,,15,,16,,35,,36. Количество пересекаемых линий сетки каждую минуту рассчитывается по сравнению с данными контроля родниковой воды за каждый день и время тестирования. Эти данные усредняясь для каждой концентрации теста за каждую минуту и сравниваются с данными управления, а также с другими концентрациями, сопоставленными по времени, используя как T-тесты студента, так и ANOVA.
Анализ pLmV направлен на изучение реагентов, влияющих на подвижность планариев в течение всего времени анализа. Детальные исследования планарных движений могут быть проведены с использованием ряда других оценок, описанных в литературе4,35,36,37,38. Поэтому разумно провести серию экспериментов по привыканию, чтобы принять к сведению, как планарианцы реагируют на испытательный реагент, используя диапазон концентраций и сравнивая любые эффекты с поведением червей в родниковой воде до начала поведенческих тестов. Таким образом, соответствующий поведенческий тест может быть выбран для изучения индивидуальных манер, индуцированных реагентом на планариане. Планарианцы могут быть помещены в различных концентрациях реагента в течение 5-10 минут, чтобы определить, если концентрация позволяет им поддерживать их типичное поведение плавание. Поведение, которое не позволяет подвижности, например, в результате C-типа, или судорожные или захвата, как поведение, были в центре внимания исследований с использованием отдельных типов поведенческих анализов, которые могут быть применены к этому методу4,39,40. анализы pLmV могут быть проведены с использованием диапазона концентраций после короткого времени привыкания и количество общих линий сетки пересекли на 3 мин забил по отношению к родниковой воды контроля до стимуляции курса времени и вывода анализов (Рисунок 4B)1,2,3,4,5. Следователям рекомендуется попробовать другие времена, такие как 15, 30 и 60 мин, чтобы увидеть, если динамика стимуляции меняется со временем воздействия1. Как сообщалось, весной черви по борьбе с водой поддерживают устойчивое, направленное вперед горизонтальное движение в течение 10 минут времени анализа1,4. В отличие от этого, обработанные продуктом черви могут остановиться и прекратить их направленную подвижность во время анализа и больше не пересекать линии сетки. Следователь может принять решение, следует ли ограничить продолжительность экспериментального запуска pLmV или получить средства для оценки такого поведения, как описано. Важно, однако, оценить частоту такого поведения, поскольку они предоставляют дополнительные данные, влияющие на подвижность. Данные о подвижности и перемещении обсуждаются отдельно на местах, поскольку объединение информации сбивает с толку оценку таких данных4,35,36,37,38. В качестве примера, два поведения наблюдались, когда черви остановились и больше не пересекали линии сетки во время анализа. Эти движения называются «блуждать» (Рисунок 5A И Рисунок 5A Дополнение), и "стоп" (Рисунок 5B И Рисунок 5B Дополнение). Частота такого поведения задокументирована в процентах от всех животных, подвергшихся воздействию определенной концентрации продукта вместе с контрольными данными (Рисунок 5C). Важно отметить, что случайное поведение, которое не мешает планариану пересекать линии сетки, должно быть включено в анализ pLmV, даже если эти движения препятствуют устойчивому прогрессу животных (Рисунок 4B, 3 мм и 10 мм баров). Как уже упоминалось, исследователи описали ряд поведенческих категорий, которые выходят за рамки этого обсуждения pLmV скорость подвижности протокола4,35,36,37,38.
Анализ pLmV опирается на воду solubility продукта под следствием. Многие из этих веществ, однако, не полностью растворимы в воде и, как таковой, только водорастворимые части могут быть проверены этим анализом, в то время как остальные должны быть отфильтрованы из раствора, как это было сделано в предыдущейработе 1. Если pLmV анализы запускаются с использованием реагентов solubilized с использованием растворителей, помимо воды, они требуют эквивалента объема контроля в дополнение к контролю родниковой воды. Хотя этот метод не был использован с такими веществами, такие векторные стихи, вероятно, следует рассматривать как тест, и подвижность забил по отношению к контролю, как и любое другое испытательное вещество. Другим возможным средством проверки нерастворимых веществ было бы кормить их планариев путем смешивания их в пищевые гели. Этот метод используется для введения siRNA для planarians в гене нокдаун / РНК экспериментов41. Кормление planarians биологических продуктов и siRNA, однако, представляет собой осложнения для этого анализа в том, что planarians не будет голодать и не могут быть переданы в контейнер анализа подвижности в течение стандартизированного времени, что обеспечивает равное воздействие или потребление продукта под следствием экспериментальных животных до тестирования.
После того, как стимулятор и вывод динамики устанавливаются с помощью анализа pLmV, дальнейшие эксперименты могут включать комодуляторы, введение siRNA, а также биологические модификаторы пути или препараты для проверки на увеличение или ингибирование наблюдаемых эффектов подвижности по сравнению с первоначальными результатами, собранными при не использованииэтих биомодуляторов 1,3. Например, снижение экспрессии гена или добавление ингибиторов путей может снизить скорость движения, в то время как другие могут изменить динамику вывода. Благодаря наблюдению измененных результатов pLmV, эти дополнительные эксперименты могут дать представление о лежащей в основе физиологии, пострадавших от природного продуктаили другого испытательного реагента 5,,42,43,44.
Описанная процедура является подоной для любой лаборатории, заинтересованной в определении стимулирующих и абстиненции эффектов различных биомодуляторов, в том числе многих натуральных продуктов. Преимущества применения анализа planarian pLmV включают в себя, насколько недороги и просты в обслуживании эти животные, и что они также могут быть предметом для других планарных анализов, чтобы обеспечить широкое понимание физиологических последствий продукта в стадии исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить, офис институционального развития, и Моррисвилл колледж Фонда для публикации гранта для поддержки этой работы, а также SUNY Моррисвилл коллегиальной научно-технической программы входа (CSTEP) за их постоянную помощь и поддержку студентов исследований в SUNY Morrisville. Мы также хотели бы поблагодарить Софию Хатченс за полезные комментарии по описанной технике.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M.
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R.
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J.
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
