يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقطير داخل الجسم للخلايا الجذعية في فئران حديثي الولادة

5.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61117

⸱

مايو 4, 2020

 ,  , 
1Department of Pediatrics, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Department of Pediatrics, Taipei Medical University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

موصوفة هو بروتوكول لإجراء زرع داخل الجسم من الخلايا الوماضة (MSCs) من خلال الحقن داخل المنطقة في الفئران حديثي الولادة مصطلح. هذه التقنية هي خيار قابل للتطبيق سريرياً لإيصال الخلايا الجذعية والأدوية إلى الرئتين الفئران حديثي الولادة لتقييم فعاليتها.

الملخص

يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى تركيزات عالية من الأكسجين إلى الالتهاب وإصابة الرئة الحادة ، والتي تشبه خلل التنسج القصبي الرئوي البشري (BPD). في الأطفال الخدج، تعتبر المعالجة بالرضع (BPD) من المضاعفات الرئيسية على الرغم من الاستخدام المبكر للعلاج بالسطح، واستراتيجيات التهوية المثلى، والتهوية الضغطية الإيجابية غير الباضعة. لأن الالتهاب الرئوي يلعب دورا حاسما في التسبب في BPD, استخدام الكورتيكوستيرويد هو واحد العلاج المحتمل لمنعه. ومع ذلك، لا ينصح عادة العلاج الكورتيكوستيرويد الجهازي للرضع الخدج بسبب الآثار الضارة على المدى الطويل. أظهرت الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية للمرحلة الأولى من الإنسان أن استخدام الخلايا الرمزية الميدية السينية (MSCs) في إصابات الرئة الناجمة عن فرط التأكسج وفي الخدج آمن وممكن. وقد ثبت أن زرع MSC داخل الرحم والوريدة يحمي من إصابة الرئة فرط الأكسدة الوليد. ولذلك، ظهرت الإدارة داخل المنطقة من الخلايا الجذعية والعلاج المشترك بين السطح وglucocorcorticoid كاستراتيجية جديدة لعلاج المواليد الجدد الذين يعانون من اضطرابات في الجهاز التنفسي. مرحلة النمو في الرئتين الفئران عند الولادة هو ما يعادل تلك التي في الرئتين البشرية في 26-28 أسبوع من الحمل. وبالتالي، فإن الفئران حديثي الولادة مناسبة لدراسة الإدارة داخل الرحم للرضع الخدج المصابين بضائقة تنفسية لتقييم فعاليتها. هذه تقنية تقطير داخل المختبر هو خيار قابل للتطبيق سريرياً لإيصال الخلايا الجذعية والأدوية إلى الرئتين.

المقدمة

وغالبا ما يتطلب الأكسجين التكميلي لعلاج الأطفال حديثي الولادة مع ضيق الجهاز التنفسي1. ومع ذلك، العلاج فرط التأكسده عند الرضع له آثار سلبية على المدى الطويل. التعرض لفترات طويلة لتركيزات عالية من الأكسجين يؤدي إلى التهاب وإصابة الرئة الحادة، وهو مشابه لخلل التنسج القصبي البشري (BPD)2. BPD هو أحد المضاعفات الرئيسية للعلاج فرط التأكسج التي يمكن أن تحدث على الرغم من العلاج السطحي في وقت مبكر، وإجراءات التهوية المثلى، وزيادة استخدام التهوية الضغط الإيجابي غير الباضع في الرضع الخدج. في حين تم الإبلاغ عن العديد من استراتيجيات العلاج لـ BPD3، لا يمكن لأي علاج معروف أن يقلل من هذه المضاعفات.

استخدام الكورتيكوستيرويد هو واحد من العلاجات المحتملة للوقاية من الالتهابات الرئوية، لأن الالتهاب الرئوي يلعب دوراً حاسماً في مرضه. ومع ذلك، لا ينصح عادة العلاج الكورتيكوستيرويد الجهازي للرضع الخدج بسبب الآثار الضارة على المدى الطويل4,5.

خلايا السترومال Mesenchymal (MSCs) لها خصائص متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية والعضلات والأوتار6. MSCs لها immunomodulatory, المضادة للالتهابات, والآثار التجديدية7, وتظهر الدراسات الحيوانية الفوائد العلاجية من MSCs ومكوناتها المفرزة في فرطوكسيا الناجمة عن إصابة الرئة في القوارض8,9. وقد ثبت أن زرع MSC داخل الرحم والوريدة يحمي من إصابة الرئة فرط الأكسدة الوليد. ولذلك، قد يكون العلاج داخل الرحم للخلايا الجذعية والعلاج المشترك بين السطح والكورتيكوستيرويد استراتيجية علاج محتملة لعلاج المواليد الجدد الذين يعانون من اضطرابات في الجهاز التنفسي. وقد استخدمت الدراسات قبل الظهرية الإدارة داخل الخلايا الجذعية وفيروس مرتبط أدينو في الفئران حديثي الولادة10,11,12. ومع ذلك، لا يتوفر عرض خطوة بخطوة لهذه التقنية وتتبع في الجسم الحي للخلايا الجذعية المزروعة. يعتبر الجرذ حديث الولادة مناسباً لدراسة آثار الإدارة داخل الرحم على الخدج المصابين بضائقة تنفسية لأن المرحلة الاكسترائية لرئة الفئران عند الولادة تعادل تلك التي في الرئة البشرية في الأسبوع 26-28 من الحمل13. طريقة فعالة لإدارة القصبة الهوائية الفئران أمر حاسم لنجاح توزيع الرئة. تسمح التقنية المعروضة هنا بدراسة الإدارة داخل الجسم للخلايا و/أو الأدوية لعلاج أمراض المواليد الرئوية باستخدام الفئران كنموذج للبشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في جامعة تايبيه الطبية على هذا الإجراء.

ملاحظة: تم الحصول على MSCs الإنسان بشكل ثابت مع البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومورثات اليراعات luciferase (Fluc) من شركة تجارية (جدول المواد).

1. توصيف MSCs الإنسان مع لوسيفراز اليراعات والبروتين الفلورسنت الأخضر

  1. الحفاظ على MSCs البشرية مع GFP وFlc في وسائل الإعلام الكاملة (الحد الأدنى من الضروري تعديل النسر ألفا المتوسطة الأساسية [αMEM] ، تستكمل مع 10-15 ٪ مصل الأبقار الجنينية [FBS] ، 2 mM L-الجلوتامين ، 1 نانوغرام / مل FGF الأساسية ، و PSF) في 37 درجة مئوية مع الرطوبة المشبعة و 5 ٪ CO2. خلايا الممر عند التقاء 70%90.
  2. مراقبة MSCs تحت المجهر الفلوري الفلوري النقيض (الشكل 1A) وتحليل مستويات التعبير من فلوك وGFP14.
  3. تميز MSCs عن طريق تحليل التعبير عن علامات القرص المضغوط بما في ذلك CD44، CD73، CD90، CD105 باستخدام تدفق قياس الاستئصال(الشكل 1B). الحث على تمايز الخوارق من الخلايا الجذعية إلى الخلايا الدهنية، وchondrocytes، والعظام، وتأكيد تمايز الخط الثلاثي(الشكل 1C)بواسطة فون كوسا، زيت O الأحمر، والأزرق ألسي تلطيخ بعد بروتوكول تجاري15،16.

2. تخدير الجراء الفئران

  1. السماح للفئران الحامل Sprague-Dawley التي مرّت وقتًا بِهِل الحملِ عن الناحية المهبلية في فترة المدى.
  2. إزالة الجراء الفئران من القفص في اليوم التالي للولادة 5.
  3. تخدير الجراء الفئران باستخدام التخدير الغاز (أي، 2٪ isoflurane) في غرفة التخدير.
  4. تأكد من التخدير الكافي عن طريق التحقق من التنفس وردود الفعل.
    ملاحظة: يجب أن يصبح التنفس ضحلاً وينبغي أن تتضاءل ردود الفعل. الجراء الفئران لا تزال فاقد الوعي لمدة لا تقل عن ~ 10 دقيقة مع هذا التركيز isoflurane.

3. تقطير داخلtracheal

  1. مرة واحدة تخدير، كبح جماح الجراء الفئران على موقف الاحتضان الزاوية في ~ 60 درجة وعقد الجراء في مكان مع شريط وضع العلامات المختبرية على جميع الأطراف الأربعة.
  2. تطبيق الشريط تحت الأنف لإصلاح الرأس وتحديد الرقبة لثقب القصبة الهوائية.
  3. تطهير منطقة شق (أي، الرقبة) مع 75٪ الكحول وسادة الإعدادية.
  4. جعل 0.3 سم شق الرقبة المتوسطة الرأسية فوق القصبة الهوائية مع ميكروسيسور لتجنب إتلاف الشرايين السباتية.
  5. تشريح الدهون والعضلات طبقات بعيدا لتحديد موقع القصبة الهوائية مع ملاقط مدبب طرف منحنية دون هوك.
  6. أمسك القصبة الهوائية مع ملاقط مدببة الرأس المنحنية.
  7. عقد حقنة 100 ميكرولتر تستقيم وحقن ببطء 30 ميكرولتر من المالحة العادية (أي، السيطرة) أو 30 ميكرولتر من Fluc-GFP المسمى MSCs (1 × 105 خلايا) في القصبة الهوائية من خلال حقنة إبرة 30 G خلال مرحلة الوسخ.
  8. إغلاق شق مع واحد 6-0 غرزة الحرير، وربط عقدة صغيرة قدر الإمكان، وقطع نهايات قصيرة قدر الإمكان.
  9. ضع الفئران تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء أو على وسادة التدفئة للحفاظ على الدفء والسماح لهم بالتعافي من التخدير.
  10. تأكد من أن الفئران دافئة وزهرية وقادرة على الحركة العفوية قبل إعادة الفئران إلى القفص.

4. رصد التوزيع الرئوي ل MSCs

  1. لتتبع MSCs البشرية المزروعة، حقن intraperitoneally الفئران مع ملح البوتاسيوم لوسفيرين في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) بجرعة من 125 ملغ/كجم من وزن الجسم 15 دقيقة بعد حقن MSC.
  2. تخدير الفئران باستخدام 2٪ isoflurane من خلال مخاريط الأنف.
  3. الحصول على الصور التسلسلية في فترات 5-15 s 10 دقيقة بعد إدارة لوسيفرين مع binning المتوسطة، 1 و / توقف، و 26 سم من حقل الرؤية باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة (جدول المواد).
  4. كمي نشاط الإنارة من الرئتين على أساس المناطق التلقائية من الفائدة باستخدام برامج التصوير (جدول المواد)17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تحديد التوزيع الرئوي للغرس داخل الخلايا الجذعية في مصطلح الفئران الوليدية بواسطة الخلايا الجذعية المسماة بـ Fluc. تم تصنيف MSCs مع Fluc وموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر من خلال تحويل فيروسات العدسي. يوضح الشكل 1A مستوى عال من التعبير GFP في MSCs البشرية، وأظهر 93.7٪ من السكان تعبيرًا إيجابيًا من GFP تم اكتشافه بواسطة قياس تدفق الدراجات. وتميزت MSCs بتحليل التعبير عن علامات CD (أي CD 44، CD73، CD90، وDD105) وقدرة تمايز الهجرات الثلاثية إلى خلايا أوستيا، وشوكوروليكيت، وأديباً

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الرضع حديثي الولادة مع ضيق الجهاز التنفسي تتطلب عادة السطح السطحي داخل المناطق التي تقع في المناطق التي تقع في المناطق التي تقع في المناطق التي تعاني من19. وقد أظهرت التجارب السريرية المرحلة الأولى الإنسان سلامة MSCs داخل المنطقة في الخدجالرضع 8. وتشير هذه الدراسات إلى أن تناول الأدوية داخل منطقة الرَّاَبِل هو خيار مهم للمواليد الجدد المصابين بضائقة تنفسية. دراسات نموذج الحيوان هي مفيدة للغاية إذا كانت ميزات النموذج هي ذات الصلة مباشرة للبشر. الجرذان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من منحة من شركة Meridigen للتكنولوجيا الحيوية المحدودة تايبيه ، تايوان (A-109-008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6-0 حريرEthicon1916G
وسادة تحضير الكحولCSD3032
BD Stemflow hMSC Analysis KitBD Biosciences562245علامات القرص المضغوط
CMV-Luciferase-EF1 & alpha ;-copGFP BLIV 2.0 Lentivector ل In Vivo ImagingSBIBLIV511PA-1
CryoStor10BioLife Solutions640222
الخلايا الجذعية البشريةMeridigen Biotech Co.، Ltd. تايبيه ، تايوان
ضوء الأشعة تحت الحمراءJING SHANGJS300T
IsofluraneHalocarbon26675-46-7
IVIS-200 نظام تصوير الصغيرةCaliper LifeSciences ، هوبكينتون ، MA
لوسيفيرين ملح البوتاسيومPromega ، ماديسون ، ويسكونسن
مقص صغير ، مستقيمVannasH4240
محلول ملحي عاديTAIWAN BIOTECH CO.، LTD.113531محلول كلوريد الصوديوم متساوي التوتر
إبرة RN ذات محور صغير ، 30 مقياسشركة هاميلتون ، رينو ، NV7799-06
حقنة (100 وميكرو ؛ ل)شركة هاميلتون ، رينو ، نيفادا81065
برنامج Xenogen Living Image 2.5Caliper LifeSciences ، Hopkinton ، MAN / A

المراجع

  1. Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
  2. Gien, J., Kinsella, J. P. Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia. Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).
  3. Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment. Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).
  4. Committee on Fetus and Newborn. Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants. Pediatrics. 109, 330-338 (2002).
  5. Watterberg, K. L. American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics. 126, 800-808 (2010).
  6. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
  7. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).
  8. Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia. American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).
  9. Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment. Stem Cell Research & Therapy. 8, 180(2017).
  10. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).
  11. Fleurence, E., et al. Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats. Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).
  12. Waszak, P., et al. Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats. Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).
  13. O'Reilly, M., Thébaud, B. Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948(2014).
  14. Yu, J., et al. GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).
  15. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  16. Zhang, Z. Y., et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem Cells. 27, 126-137 (2009).
  17. Huang, L. T., et al. Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice. Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).
  18. Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).
  19. Yeh, T. F., et al. Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).
  20. Nguyen, J. Q., et al. Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis. Journal of Visualized Experiments. (127), e56123(2017).
  21. de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).
  22. Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. In vivo cell tracking with bioluminescence imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الخلايا الجذعية الميزنكيميةتصوير اللوسيفيرازإجراء استئصال القصبة الهوائيةزراعة الخلاياقياس التلألؤ البيولوجيإصابة الرئة الناجمة عن فرط التأكسجتعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP)
تقطير داخل الجسم للخلايا الجذعية في فئران حديثي الولادة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.