풋패드 접종 모델은 생체 내에서 바이러스 유발 신경 염증 반응을 특성화하는 데 중요한 도구입니다. 특히, 말초 신경계에서 시작된 바이러스 운동 및 관련 면역 병리학 적 과정에 대한 명확한 평가를 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜은 마우스에 있는 alphaherpesvirus 감염 도중 신경 선동적인 반응의 개시 그리고 발달을 연구하기 위하여 이용된 발판 접종 모형을 기술합니다. 알파헤르페스바이러스는 말초 신경계(PNS)의 주요 침략자이기 때문에, 이 모델은 바이러스 복제의 운동, PNS에서 CNS로의 확산, 관련 신경염증 반응을 특성화하는 데 적합합니다. 풋패드 접종 모델은 바이러스 입자가 발바닥 표피의 1차 감염 부위에서 표피, 땀샘 및 진피를 내면화하는 감각및 교감 신경 섬유로 확산될 수 있게 합니다. 감염은 등대 근간 (DRG)에 상반신 신경을 통해 궁극적으로 뇌에 척수를 통해 퍼짐. 여기서, 마우스 풋패드는 포진 심플렉스 바이러스(HSV) 및 수두-동물 바이러스(VZV)와 밀접한 관련이 있는 알파헤르페스 바이러스인 의사 바이러스(PRV)로 접종된다. 이 모델은 PRV 감염이 풋패드와 DRG에 호중구 침투를 특징으로 하는 심각한 염증을 유발한다는 것을 보여줍니다. 염증성 사이토카인의 고농도는 ELISA에 의해 균질화 된 조직에서 이후에 검출됩니다. 또한, DRG에서 PRV 유전자와 단백질 발현(qPCR 및 IF 염색을 통해) 및 프로 염증성 사이토카인의 생산 사이에 강한 상관관계가 관찰된다. 따라서, 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 유도 신경병증의 근본적인 과정을 더 잘 이해하고 혁신적인 치료 전략의 개발로 이어질 수 있다. 또한, 모델은 다발성 경화증 및 PNS에 대한 바이러스 유발 손상과 같은 말초 신경병증에 대한 연구를 안내할 수 있다. 궁극적으로, 그것은 약물 개발을 위한 생체 내 공구에서 비용 효과적인 역할을 할 수 있습니다.
서론
이 연구는 PNS에서 CNS 및 관련 신경 염증 반응에 바이러스의 복제 및 확산을 조사하기 위하여 발판 접종 모형을 기술합니다. 풋패드 접종 모델은 뉴런,1,2,23에서알파헤르페스바이러스 감염을 연구하는 데 집중적으로 사용되어 왔다. 이 모델의 주요 목적은 신경 tropic 바이러스 CNS에 도달 하기 전에 PNS를 통해 최대 거리를 여행 할 수 있도록 하는 것입니다. 여기서, 이 모형은 의사 바이러스 (PRV)에 감염된 마우스에 있는 특정 신경병증 (신경병성 가려움)의 발달에 있는 새로운 통찰력을 얻기 위하여 이용됩니다.
PRV는 감기 염증, 생식기 병변 및 수두를 유발하는 몇 가지 잘 알려진 병원체(즉, 헤르페스 심플렉스 타입 1 및 2 [HSV1 및 HSV2] 및 수두-동물 바이러스 [VZV]와 관련된 알파헤르페스바이러스로, 각각4. 이 바이러스는 모두 pantropic 및 특정 조직 유형에 대 한 친화성을 표시 하지 않고 많은 다른 세포 유형을 감염시킬 수. 그러나, 그들은 모두 PNS를 침범 하 여 특징적인 신경 tropism....
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프로토콜
모든 동물 실험은 프린스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인 된 프로토콜 (번호 2083-16 및 2083-19)에 따라 수행되었습니다. 이 작업은 엄격하게 생물 안전 수준 2 (BSL-2) 요구 사항을 따라 수행되었다, 우리는 프린스턴 대학 생물 안전위원회에 의해 승인 된 완비 된 실험실이있는. 마우스 풋패드 마모, 바이러스 접종, 마우스 해부 및 조직 수집을 포함한 절차는 프린스턴 대학 생물 봉쇄 동물 시설 실의 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 수행되었다. 시술을 수행하는 사람들은 일회용 가운, 머리 덮개, 눈 보호, 멸균 장갑, 수술 용 마스크 및 신발 커버를 착용했습니다.
1. 마우스 풋패드 마모
- C57BL/6 마우스(5-7주 전)를 이소플루란 가스 마취제로 마취 시스템(chamber)을 통해 3%의 투여량으로 전달한다.
- 접종 전에 마취의 수술 평면에 마우스를 뒷발에 놓습니다. 다이어프램(동물의 총구에 맞게 충분히 크기가 충분한 슬릿)을 가진 코 콘을 마우스에 부착하고 1.5%-2.0%의 일정한 투여량으로 이소플루란 가스 마취제를 전달한다.
- 마우스를 면밀히 모니터링하여 발가락을 강제로 집게하여 생성한 고통스러운 자극에 대한 반응을 제공합니다.....
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결과
마우스 풋패드 접종 모델은 생체 내에서 알파헤르페스바이러스 감염의 면역병증의 특성화를 허용하며, 이는 접종된 풋패드에서 신경계로의 감염의 복제 및 확산을 포함하고 특정 신경염증 반응의 유도를 포함한다.
이 연구에서는 마우스 뒷발패드를 먼저 밟고 모의 접종을 하거나 PRV(PRV-Becker)의 악성 균주로 아브라드 부위를 접종했습니다. 마모 부위는 제어 풋패드에 표시되었습니다. 치유 과정의 일환으로 찰과 부위에 지각이 형성되었다(도1,검은 화살). 대조적으로, PRV로 접종된 마우스는 풋패드의 붓기와 발적을 특징으로 하는 인도적 종점(82hpi)에서 심한 염증을 보였다.
악성 PRV-베커 균주를 가진 발판 접종에 따라, 마우스는 접종된 발판의 팽윤 및 점점 더 빈번한 떨림을 특징으로 하는 72 hpi에서 임상 표시를 보여주기 시작했습니다. 82마피로, PRV-베커 감염된 마우스.......
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토론
여기에 설명된 풋패드 접종 모델은 알파헤르페스바이러스 감염 시 신경염증 반응의 개시 및 발달을 조사하는 데 유용하다. 더욱이, 이 생체 내 모델은 PNS에서 CNS로 알파헤르페스바이러스의 복제 및 확산의 역학을 확립하는 데 사용된다. 이는 깊은 진피스크래치(13)또는 CNS14,,15,16에바이러스를 직접 도입하는 두개내 경로에 의존하는 측면 피부 접종모델과같은 다른 접종 모델과 대체이다. 그 결과, 풋패드 모델을 통해,신경계(11,,12)에서관련 국소 및 먼 면역병리학적 과정과 함께 복제및 확산의 바이러스 역학에 대한 보다 상세한 평가를 얻을 수 있다.
이 프로토콜에.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 역사 병리학 분석을 실행하는 우수한 기술 지원에 대한 찰스 강 실험실을 인정합니다. 이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소에 의해 투자되었다 (NINDS) (RO1 NS033506 및 RO1 NS060699). 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항체 항 PRV gB | 실험실 | 1/500 희석 | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards -24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL / 6 마우스 (5-7 주) | The Jackson 실험실 | ||
| DAPI 용액 (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 희석 |
| 일회용 멸균 폴리스티렌 페트리 접시 100 x 15 mm | 시그마-알드리치 | P5731500 | |
| 둘베코의 변성 이글 배지(DMEM) | 하이클론, GE 헬스케어 생명과학 | SH30022 | |
| 둘베코의 인산염 완충액 식염수(PBS) 용액 | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| 포르말린 용액, 중성 완충 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| 마이크로튜브 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| 음성 염소 혈청 | Vector | S-1000 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco | 154022 | |
| 정밀 글라이드 바늘 18G | BD | 305196 | |
| 면도날 스틸 백 | Personna | 9412071 | |
| RNA 용해 완충액 (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| 스테인레스 스틸 비드, 5mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost / plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (염소 안티 마우스) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 희석 |
참고문헌
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spr....
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