Het doel van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test is om oxidatieve stress in biologische monsters te beoordelen door de productie van lipide peroxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde, te meten met behulp van zichtbare golflengtespectrofotometrie bij 532 nm. De hier beschreven methode kan worden toegepast op menselijk serum, cellysaten en lipoproteïnen met lage dichtheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van oxidatieve stress in biologische monsters met behulp van de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen test
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondanks zijn beperkte analytische specificiteit en robuustheid, is de thiobarbiturinezuur reactieve stoffen (TBARS) -test op grote schaal gebruikt als een generieke metriek voor lipideperoxidatie in biologische vloeistoffen. Het wordt vaak beschouwd als een goede indicator van de niveaus van oxidatieve stress in een biologisch monster, op voorwaarde dat het monster op de juiste manier is behandeld en opgeslagen. De test omvat de reactie van lipideperoxidatieproducten, voornamelijk malondialdehyde (MDA), met thiobarbiturinezuur (TBA), wat leidt tot de vorming van MDA-TBA2-adducten genaamd TBARS. TBARS levert een rood-roze kleur op die spectrofotometrisch gemeten kan worden bij 532 nm. De TBARS-test wordt uitgevoerd onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C. Zuivere MDA is onstabiel, maar deze omstandigheden maken het mogelijk om MDA vrij te maken uit MDA bis (dimethylacetaal), dat in deze methode als analytische standaard wordt gebruikt. De TBARS-test is een eenvoudige methode die in ongeveer 2 uur kan worden voltooid. De bereiding van assay-reagentia wordt hier in detail beschreven. Prijsbewuste onderzoekers kunnen deze reagentia voor meerdere experimenten tegen lage kosten gebruiken in plaats van een dure TBARS-testkit te kopen die alleen de constructie van een enkele standaardcurve mogelijk maakt (en dus slechts voor één experiment kan worden gebruikt). De toepasbaarheid van deze TBARS-test wordt aangetoond in menselijk serum, lipoproteïnen met lage dichtheid en cellysaten. De test is consistent en reproduceerbaar en detectiegrenzen van 1,1 μM kunnen worden bereikt. Aanbevelingen voor het gebruik en de interpretatie van de spectrofotometrische TBARS-test worden gegeven.
Inleiding
Lipideperoxidatie is een proces waarbij vrije radicalen, zoals reactieve zuurstofsoorten en reactieve stikstofsoorten, koolstof-koolstof dubbele bindingen in lipiden aanvallen, een proces waarbij een waterstof uit een koolstof wordt gewonnen en een zuurstofmolecuul wordt ingebracht. Dit proces leidt tot een mengsel van complexe producten, waaronder lipide peroxylradicalen en hydroperoxiden als primaire producten, evenals malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenaal als overheersende secundaire producten1.
MDA is veel gebruikt in biomedisch onderzoek als een marker van lipideperoxidatie vanwege de gemakkelijke reactie m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke serummonsters werden verkregen van instemmende vrijwilligers onder IRB-goedkeuring en volgens de principes die zijn uitgedrukt in de Verklaring van Helsinki. Monsters werden gecodeerd en gedeïdentificeerd voordat ze naar het analytisch laboratorium werden overgebracht.
1. Monstervoorbereiding
- HepG2-cellysaten
- Zaai ongeveer 10 x 106 HepG2-cellen per kolf in 16 T75-kolven met 14 ml EMEM-media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en kweekcellen gedurende 2 dagen.
- Bereid RIPA-buffer voor: voeg in een buis van 50 ml 1,5 ml 5 m NaCl, 2,5 ml 1 m Tris-HCl (pH = 7), 500 μl ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onder zure omstandigheden (pH = 4) en bij 95 °C levert malondialdehyde (MDA) bis(dimethylacetaal) MDA23 op. MDA en nauw verwante chemische congeneren reageren met twee moleculen thiobarbiturinezuur (TBA) om verbindingen te produceren die thiobarbiturinezuurreactieve stoffen (TBARS) worden genoemd, die een roodroze kleur geven en een absorptie λmax hebben bij 532 nm (figuur 1, figuur 2). Met MDA bis (dimethylacetaal) als standaa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ondanks zijn beperkingen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 en een gebrek aan geschiktheid voor vergelijking tussen laboratoria, is de TBARS-test een van de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Het hier gerapporteerde onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award no. R33 CA217702 en het Initiative for Maximizing Student Development (IMSD) programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële mening van de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642--262 | cel lysis reagens |
| 50 mL zelfstandige centrifugeerbuis | Corning, NY | CLS430897 | Algemeen materiaal |
| 96-wellplaat, niet-behandeld, helder, met deksel, niet-steriel | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | Om absorptie te meten |
| Amicon Ultra-0,5 100 kD centrifugaal spinfilterapparaat | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL-zuivering |
| Doppen voor glazen buizen | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | voor TBARS-test |
| Koper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | om oxidatie te induceren |
| Kweekbuisjes, wegwerpbaar, met schroefdop, boorsilicaatglas (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | voor TBARS-test |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2-celmedium |
| Eppendorf Safe-Lock buizen, 1,5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | Algemeen materiaal |
| Eppendorf Safe-Lock buizen, 2,0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | Algemeen materiaal |
| Fetaal bovien serum US-bron | Omega Scientific, CA | FB-11 | voor celkweek |
| Glazuur azijnzuur | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS-reagens |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cel lysis reagens |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL-oplosmiddel |
| HepG2-cellen | ATCC, VA | HB-8065 | Biologische matrix prototype |
| Hydrochloorzuur (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cel lysis reagens |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | Algemeen materiaal |
| Laag dichtheid Lipoproteïne, menselijk plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biologische matrix prototype |
| Magnetische roerstaven, achthoek 6-sortiment | VWR, PA | 58948-025 | Algemeen materiaal |
| Malondialdehyde bis (dimethylacetaal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS-standaard |
| Multiskan Go Microplate Spectrofotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | Om absorptie te meten |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cel lysis reagens |
| Natriumchloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cel lysis reagens |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS-reagens |
| Natriumhydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS-reagens |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | Voor het concentreren van cellopbrenging |
| T-75 Kolf, behandeld voor weefselcultuur, 250 mL, met filterdop | USA Scientific, FL | 658175 | celkweek |
| Thiobarbituurzuur | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS-reagens |
| TRIS-basis | Fluka, GA | 93362 | cel lysis reagens |
| Trypsine (1x) | VWR, PA | 16777-166 | Om HepG2-cellen los te maken |
Referenties
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
