通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜在异源细胞系统中快速、半定量地检测反式配体-受体相互作用。

摘要

细胞界面处的蛋白质相互作用决定了多种生物学结果，从组织发育和癌症进展到突触的形成与维持。许多这类基本相互作用以反式（trans）方式进行，通常由表达膜锚定结合配对的细胞之间发生异嗜性或同嗜性相互作用所引发。阐明与疾病相关的突变如何破坏这些基本的蛋白质相互作用，可为众多细胞生物学领域提供重要见解。目前许多蛋白质-蛋白质相互作用检测方法通常无法区分顺式（cis）与反式（trans）相互作用，可能导致对体内实际结合程度的高估，且往往涉及耗时的蛋白质纯化步骤和/或需要专门的监测设备。本文介绍一种经过优化的简便实验方案，可在无需 lengthy 蛋白质纯化或专用设备的情况下，特异性地观察和定量反式相互作用。该HEK细胞聚集实验包括混合两群独立的HEK细胞，每群细胞分别表达膜结合的对应配体。经过短暂孵育后，对样品进行成像并定量分析所形成的细胞聚集体。

引言

突触黏附分子介导的突触相互作用是突触发育、组织、特化、维持和功能以及神经网络形成的基础。目前发现的跨突触细胞黏附分子数量迅速增加，因此，鉴定这些新黏附分子的结合伴侣并理解它们之间的相互作用方式具有根本性的重要意义。此外，基因组测序已发现许多此类黏附分子基因中的突变，这些突变通常与多种神经发育障碍、神经精神疾病及成瘾性疾病相关¹。编码突触细胞黏附分子的基因发生突变可能有害地改变跨突触相互作用，并可能导致突触形成和/或维持过程中的病理生理学改变。

目前已有多种定量检测蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法，例如等温滴定 calorimetry、圆二色光谱法、表面等离子共振²，这些方法虽然具有定量性，但仍存在若干局限性。首先，它们需要使用重组蛋白，有时还需进行耗时且繁琐的纯化步骤。其次，这些方法依赖复杂的专用设备和技术专长。第三，由于允许在体内天然锚定于膜上的蛋白质之间发生顺式（cis）和反式（trans）相互作用，可能导致对结合程度的高估。本文中，我们提出一种简单且相对快速的实验方法，专门用于检测反式（trans）相互作用。

为避免纯化蛋白检测中常见的诸多复杂问题，我们优化了一种基于细胞的蛋白质相互作用检测方法，可在简化的异源细胞系统中重现跨细胞相互作用。该方法此前已以多种形式被用于研究跨细胞相互作用。在此方法中，将候选的细胞黏附分子转....

方案

1. 细胞培养与转染

1. 使用DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，配制HEK细胞培养基 & 氯化钠、丙酮酸钠和10% FBS。无菌过滤。
2. 预先确定适用于聚集试验的合适配体和受体。
   注意：本研究使用了Neurexin3α SS4+/-及其已知配体之一LRRTM2。感兴趣的配体和受体均通过克隆至pcDNA3.1载体中的cDNA进行表达。采用Gibson组装法将Neurexin3α插入pcDNA3.1载体中¹². Neurexin3α F/R：TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT
3. 准备HEK293T细胞。
   1. 在1个T-75培养瓶中将HEK293T细胞培养至汇合。
   2. 待细胞融合后，加入2 mL胰蛋白酶，置于37 °C培养箱中消化2 min。向培养瓶中加入6 mL HEK培养基重悬细胞，并将全部8 mL细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
   3. 500 × g 离心沉淀 g 5分钟，然后重悬于HEK细胞培养基中，总体积为8 mL。
   4. 计数细胞，并将7....

结果

A687T 突变增强 Neurexin3α SS4- 与 LRRTM2 的结合能力⁷
为了研究在一位患有智力障碍和癫痫的患者中发现的点突变如何影响两种已知突触蛋白之间的细胞间相互作用，我们采用了上述 HEK 细胞聚集实验（图 1）。细胞根据方案第 1 节进行转染，并按照第 1 和第 2 节步骤准备成像。在基线条件下成像时，未观察到细胞聚集，结果符合预期（未展示）。在 60 分钟时采集的图像按照方案第 3 节进行分析。为尽量减少选择偏倚，实验条件进行了随机化处理，以对实验操作者设盲。出于类似原因，每张图像的整个视野均被选为感兴趣区域（ROI）。

在细胞不表达任何突触配体（GFP/mCherry）的条件下，经过60分钟孵育后仅观察到极少的细胞聚集（图2）。同样，在仅有一类细胞群体表达突触配体（mCherry/LRRTM2-GFP 或 GFP/Neurexin3α^WT/A687T SS4−—mCherry）的条.......

讨论

解析细胞黏附过程中发生的跨细胞（trans）蛋白质-蛋白质相互作用，有助于更好地理解基本细胞过程背后的分子机制，包括在成熟和重塑过程中突触的形成、功能及维持。细胞间相互作用的意义不仅限于神经生物学，还在信号转导、细胞迁移和组织发育中发挥更广泛的作用¹⁴。细胞黏附的异常可破坏对正常细胞功能至关重要的细胞过程，并可能导致多种疾病的发生，如癌症、关节炎、成瘾、自闭症和精神分裂症^1,15,16。本文提供了一种经过优化的详细实验方案，涉及HEK细胞聚集，可用于检测跨细胞的细胞黏附相互作用。

通过该HEK细胞聚集实验方案，我们可以解析细胞聚集的差异，从而近似评估突触前蛋白与其突触后配体之间的结合能力。因此，我们可以提出如下问题：两个关键突触蛋白之间的相互作用是否受到点突变的影响？更具体而言，Neurexin3α与LRRTM2之间的跨细胞相互作用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 一次性带盖离心管	VWR	89000-028	HEK细胞混合群体的孵育
1000 mL 快速法—0.2 微米 aPES 膜流动过滤单元	赛默飞世尔科技	567-0020	HEK培养基的灭菌
15 mL SpectraTube 离心管	沃德’科学	470224-998	收获HEK细胞
6 孔无菌组织培养板	VWR	100062-892	培养HEK细胞
氯化钙	Sigma	223506-500G	磷酸钙转染，HEK细胞重悬
离心机 - Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	收获HEK细胞
CO2细胞培养箱	赛默飞世尔科技	HERACELL 150i	HEK细胞生长过程中的孵育
DMEM，1×（伊格尔培养基的达爾伯克改良型），含4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺 &和丙酮酸钠	康宁	10-013-CV	HEK细胞培养与维持
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 PBS (1X)	Gibco	14190-144	传代/收获HEK细胞
乙二胺四乙酸	Sigma	ED-500G	收获HEK细胞
Falcon 透气培养瓶，75 cm²2 生长区域	康宁	9381M26	培养HEK细胞
胎牛血清	Sigma	17L184	HEK细胞培养与维护
HEK293T细胞	ATCC		模型系统
ImageJ	美国国立卫生研究院	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	图像分析
六水合氯化镁	Sigma	M9272-500G	HEK 细胞重悬液
无水磷酸氢二钠	Fisher BioReagents	BP332-500	磷酸钙转染
0.25% (1X) 胰蛋白酶溶液	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	传代培养HEK细胞
试管旋转仪			HEK细胞混合群体的孵育
UltraClear 显微镜载玻片。白色磨砂，正电荷	Denville Scientific Inc.	M1021	图像采集
宽场显微镜	Zeiss	Axio Vert 200M	图像采集