Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

Résumé

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.

Résumé

Les interactions protéiques aux interfaces cellulaires dictent une multitude de résultats biologiques allant du développement tissulaire et de la progression du cancer à la formation et à l’entretien de la synapse. Bon nombre de ces interactions fondamentales se produisent en trans et sont généralement induites par des interactions hétérophiliques ou homophiliques entre les cellules exprimant des paires de liaisons ancrées dans la membrane. L’élucidation de la façon dont les mutations pertinentes à la maladie perturbent ces interactions protéiques fondamentales peut donner un aperçu d’une myriade de domaines de biologie cellulaire. De nombreux analyses d’interaction protéine-protéine ne se désambigulent généralement pas entre les interactions cis et trans, ce qui conduit potentiellement à une surestimation de l’étendue de la liaison qui se produit in vivo et impliquent la purification à forte intensité de main-d’œuvre des protéines et / ou de l’équipement de surveillance spécialisée. Ici, nous présentons un protocole simple optimisé qui permet l’observation et la quantification des interactions trans seulement sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipements spécialisés. L’analyse d’agrégation cellulaire HEK implique le mélange de deux populations indépendantes de cellules HEK, chacune exprimant des ligands cognate liés à la membrane. Après une courte période d’incubation, les échantillons sont photographiés et les agrégats qui en résultent sont quantifiés.

Introduction

Les interactions synaptiques facilitées par les molécules d’adhérence synaptique sont fondamentales pour le développement, l’organisation, la spécification, la maintenance et la fonction des synapses et la génération de réseaux neuronaux. L’identification de ces molécules transsynaptiques d’adhérence de cellules augmente rapidement ; il est donc fondamentalement important d’identifier des partenaires contraignants et de comprendre comment ces nouvelles molécules d’adhérence interagissent les unes avec les autres. En outre, le séquençage du génome a identifié des mutations dans beaucoup de ces molécules d’adhérence qui sont généralement liées à une multitude de trouble....

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection

1. Faire des médias cellulaires HEK avec DMEM, 1x (Modification de Dulbecco de Eagle’s Medium) complété par 4,5 g/L de glucose, L-glutamine & pyruvate de sodium et 10% FBS. Filtre stérile.
2. Prédéterminer les ligands et les récepteurs appropriés pour l’analyse d’agrégation.
   REMARQUE : Neurexin3α SS4+/- et l’un de ses ligands connus, LRRTM2, ont été utilisés dans cette étude. Ligands et récepteurs d’intérêt ont été exprimés des CDNA dans pcDNA3.1. Un assemblage Gibson a été utilisé pour insérer Neurexin3α dans pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGCGCCCCCCATGAGCTTTACCCCACTC/....

Résultats

La mutation A687T augmente Neurexin3α SS4- liaison à LRRTM2⁷
Pour étudier comment les interactions intercellulaires de deux protéines synaptiques connues sont affectées par l’introduction d’une mutation ponctuelle trouvée chez un patient souffrant de déficience intellectuelle et d’épilepsie, nous avons utilisé l’analyse d’agrégation cellulaire HEK ci-dessus (figure 1). Les cellules ont été transfectées selon l’article 1 et préparées pour l’imagerie selon les se.......

Discussion

Disséquer les interactions protéine-protéine qui se produisent en trans pendant l’adhérence cellulaire peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus cellulaires de base, y compris la formation, la fonction et le maintien des synapses pendant la maturation et le remodelage. Les implications des interactions cellule à cellule s’élargissent au-delà de la neurobiologie et jouent un rôle plus large dans la transduction du signal, la migration cellulaire et le développement<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes jetables de 1,5 mL avec bouchons à pression	VWR	89000-028	Incubation de population mixte de cellules HEK
1000 mL Rapid&mdash ; Unité de filtration à flux, membrane aPES de 0,2 μm	Thermo Fisher	567-0020	Stérilisation des médias HEK
15 mL Tubes à centrifuger SpectraTube	Ward' s Science	470224-998	Récolte de cellules HEK
6 plaques de culture de tissus bien stériles	VWR	100062-892	Culture de cellules HEK
Chlorure de calcium	Sigma	223506-500G	Transfection de phosphate de calcium, remise en suspension de cellules HEK
Centrifugeuse- Sorvall Legend RT	Kendro Produits de laboratoire	75004377	Récolte de cellules
HEK Incubateur de	cellules CO2Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation de cellules HEK pendant la croissance
DMEM, 1x (Modification de Dulbecco du milieu d’Eagle) avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium	Corning	10-013-CV	des cellules
HEK Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passage/récolte Cellule HEK
Acide éthylènediaminetétraacétique	Sigma	ED-500G	Récolte de cellules HEK
Falcon Fioles de culture ventilées, 75cm2 surface de croissance	Corning	9381M26	Élevage de cellules HEK
Sérum fœtal bovin	Sigma	17L184	Entretien
HEK293T cellules	ATCC		Système modèle
ImageJ	NIH	V : 2.0.0-rc-69/1.52p	Analyse d’images
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma	M9272-500G	Resuspension cellulaire HEK
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Fisher BioReagents	BP332-500	Transfection de phosphate de calcium
Trypsine 0,25 % (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passage de cellules HEK
Rotateur			de tube Incubation d’une population mixte de cellules HEK
Lames de microscope UltraClear. Blanc givré, chargé positivement	Denville Scientific Inc.	M1021	Acquisition d’images
Microscope grand champ	Zeiss	Axio Vert 200M	Acquisition d’images

Maintenance des cellules HEK