pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם - מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבות של פריציטים נומי מוח למדידות סידן ציטוסולית מחקרי הדמיית סידן
במאמר זה
סיכום
תקציר
Pericytes קשורים עם תאים אנדותל ו endfeet אסטרוציטים במבנה המכונה היחידה הנוירוסקולרית (NVU). תפקוד פריציט נמת המוח אינו ידוע במלואו. Pericytes הוצעו להיות מעורבים בפיתוח נימי, רגולציה של מחסום אנדותל ופעילות trancytosis, רגולציה של טון נימי ולשחק תפקידים מכריעים בפתולוגיות מוח מסוימות.
Pericytes מאתגרים לחקור במוח שלם בשל הקשיים בהדמיה תהליכים parenchyma במוח, כמו גם את הקרבה לתאים האחרים של NVU. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד ותרבות של pericytes נימות המוח הראשי של המוח של פר והשימוש הבא שלהם במחקרי הדמיית סידן, שבו ניתן לחקור השפעות של אגוניסטים המעורבים איתות מוחי ופתולוגיות. שברי נימים קליפתיים מותר לצרף לתחתית מבחנות תרבות, ולאחר 6 ימים, תאים אנדותל וpericytes גדלו מתוך שברי נימים. תאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה pericytes הם תרבותיים במשך 5 ימים נוספים לפני המעבר.
pericytes מבודד נזרעים 96-well צלחות תרבות טעון עם צבע מחוון סידן (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) כדי לאפשר מדידות של רמות סידן תאי בהגדרת קורא צלחת. לחלופין, pericytes הם זרעים על כיסויים רכוב בתאי תא. לאחר טעינה עם מחוון הסידן (Cal-520 AM), סידן חי הדמיה יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal באורך גל העירור של 488 nm ואורך גל פליטה של 510-520 נה"מ.
השיטה המתוארת כאן שימשה כדי להשיג את מדידות סידן תאי הראשון מpericytes המוח הראשי, המוכיח כי pericytes מגורה באמצעות ATP והם מסוגלים להתכווץ במבחנה.
מבוא
פריציטים נימי המוח, יחד עם תאים אנדותל ואסטרוציטים, מהווים NVU1,2,3. תאי אנדותל, אשר מהווים את הבסיס המבני של הנימים, יוצרים צינורות גליליים ארוכים בקוטר של 5-8 μm. תאי ה אנדותל מכוסים באופן אקראי בpericytes ומוקפים בולטות של אסטרוקיטים; כפות החיים של האסטרוציט.
מחסום הדם - מוח (BBB), ממוקם נימים במוח, הוא האתר העיקרי להחלפת חומרים מזינים, גזים ומוצרי פסולת בין המוח והדם. BBB גם מגן על המוח מפני רעלנים עצביים אנדוגניים אקסוגניים ומשמש כמחסום למסירה של מספר רב של תרכובות סמים. פונקציית המחסום היא אזור מיקוד, כמו גם מכשול, עבור חברות תרופות המפתחות ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת מאגרים ופתרונות לקליטת תאים
- להכין פתרון מלאי קולגן על ידי המסת 5 מ"ג קולגן הרביעי מהשיה האנושית ב 50 מ"ל של PBS לילה ב 4 ° C. Aliquot פתרון המניות לתוך 5 מ"ל מנות ולאחסן ב -20 ° C.
- להכין פתרון מלאי פיברונקטין על ידי המסת 5 מ"ג של פיברונקטין ב 5 מ"ל של מים סטריליים בן לילה. לאחסן את מניות פיברונטין ב aliquots של 500 μL ב -20 ° C. בעת הפשרה, הוסף PBS לנפח סופי של 50 מ"ל כדי להכין את פתרון העבודה ולאחסן אותו ב- 4 °C.
- להכין את דן הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום של פרווין עוברי (FBS), 5 מ"ל של חומצות אמינו MEM לא חיוניות ו 5 מ"ל של פניקillin / סטרפטומיצין (0.1 גרם / L סטרפטומיצין גופרתי ו 100,000 U / L פניצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נימים במוח של פר בודדו רקמת מוח טרייה ואיור 1 מציג את זריעת הנימים ואת ההתגלות התאית במשך ימים וטיהור של pericytes לאחר מכן. הנימים מחוברים באופן מלא לנבון ביום הראשון וביום השני נבט אנדותל הפך גלוי(איור 1,יום 2). לאחר 4 ימים, ההתגלות הסלולרית היא ייחודיתמאוד (איור 1,יום 4א) ותאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה כפי על פי הפרוטוקול המתואר. שרידי הנימים יכולים להיות נוכחים לאחר הנספים, אך ייעלמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר זה, אנו הציגו שיטה לבודד pericytes ראשוני ממוחות של קבר. הפרוטוקול המתואר מאפשר תרבות מסוג תא זה, שאחרת אינו נגיש. תרבות התא שהושגה לאחר מכן הייתה אוכלוסייה כמעט הומוגנית של pericytes, עם זיהום קטן או ללא עם תאים אנדותל ותאי גליה המבוססים על מורפולוגיה של תאים וביטויחלבון 12. יתר על כן, הראינו שיטה פשוטה וישירה כדי לטעון את pericytes עם צבעי סידן עבור Ca2+-הדמיה באמצעות שתי שיטות שונות, בהתאם לתוצאה המיועדת.
אחת הבעיות העיקריות בעת בידוד תאים ראשוניים מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים רוצים להכיר במימון מיוזמת המחקר של קרן לונדבק על מחסומי מוח ואספקת סמים (RIBBDD) וקרן משפחת סיימון הוגר.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| חממת תאים | תרמו פישר | ||
| פישר | הראוס מולטיפפוגה 3SR + | צנטריפוגה סטנדרטית בנפח גדול לספינינג תאים | |
| קולגן IV | סיגמא אולדריץ' | C5533 | |
| סריקת לייזר קונפוקלית מיקרוסקופ | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | מיקרוסקופ הפוך |
| FastRead | 102 | ||
| תא תא Coverslip | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | שנודע בעבר בשם Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| מדיום הנשרים השונה של Dulbecco | Sigma Aldrich | D0819 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| פיברונקטין | סיגמא אולדריץ' | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| כיסויי זכוכית 22x22 מ"מ | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| מיקרוסקופ אור | אולימפוס | אולימפוס CK2 | מיקרוסקופ אור זקוף עם ניגודיות פאזה |
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות | סיגמא אולדריץ' | M7145 | |
| קורא מיקרופלייט | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | סיגמא אולדריץ' | D8537 | מלח חוצץ פוספט |
| G נתרן/סטרפטומיצין סולפט | סיגמא אולדריץ' | P0781 | |
| פלורוניק F127 | סיגמא אולדריץ' | P2443 | |
| טריפסין-EDTA | סיגמא אולדריץ' | T4299 | |
| T-75 בקבוק | סיגמא אולדריץ' | CLS3972 | |
| צלחת 96 בארות | קורנינג משולבת | 3603 |
מקורות
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-e....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
