פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטרת הדרכה זו היא לתאר את הכנת קפל קול החולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי. פרוטוקול זה מתאר נהלים לניתוח שומן חולדה, הקפאת הבזק, ו cryosectioning של קפלי הקול. מחקר זה מתאר כיצד להקרין קפלי קול הן במישורים אורך והן במישור חתך. חידוש של פרוטוקול זה הוא מעקב שומן במהלך cryosectioning המבטיח זיהוי מדויק של שרירי השומן המהותיים ומפחית את הסיכוי לאובדן רקמות. הנתונים ממחישים את ההקפאה המתקדמת בשני המטוסים. עשרים ותשע שומן-שומן חולדה היו cryosectioned ועקבו מהופעת הסחוס בבלוטת התריס להופעת החלק הראשון שכלל את קפל הקול המלא. קפל הקול המלא היה דמיינו עבור כל בעלי החיים בשני המטוסים. הייתה שונות גבוהה במרחק מהופעת הסחוס בבלוטת התריס ועד להופעת קפל הקול המלא בשני המטוסים. המשקל לא היה בקורלציה לעומק של ציוני דרך שומן, דבר המצביע על שונות אישית וגורמים אחרים הקשורים להכנת רקמות עשוי להיות אחראי על השונות הגבוהה במראה של ציוני דרך במהלך חתך. מחקר זה מפרט מתודולוגיה ומציג נתונים מורפולוגיים להכנת קפל קול החולדה לחקירה נוירו-שרירית היסטוכימית. בשל שונות אינדיבידואלית גבוהה, ציוני דרך נזלת צריך להיות במעקב צמוד במהלך cryosectioning כדי למנוע גירוי יתר של רקמות ואובדן רקמות. השימוש במתודולוגיה עקבית, כולל הכנת רקמות נאותה ומודעות לציוני דרך בתוך הגרון של החולדה, יסייע בתוצאות עקביות במחקרים ויסייע לחוקרים חדשים המעוניינים להשתמש בקפל הקול של החולדה כמודל לחקור מנגנונים עצביים-שריריים גרון.
מבוא
גרון החולדה הוא מודל מבוסס היטב לחקור התאמות גרון עצבי שרירי מבני ותפקודי להתפתחות, הזדקנות, מחלות, סוכנים פרמקולוגיים1,2,3,4,5. עקביות של שיטות היסתולוגיות היא קריטית לקו עבודה זה, שכן ישנם מורכבויות מרובות המעורבות בהכנת שרירים וניתוח, כמו גם אתגרים הקשורים לגודל, צורה וטופוגרפיה של השרירים עטופים בתוך הסחוסים הרינג'אלים1,6,7,8,9,10,11 . בשל הגודל הקטן של שרירי השומן המהותיים של החולדה, הטמעה שיטתית, הקפאה והקפאה הם קריטיים להשגת תוצאות עקביות ומדויקות. לדוגמה, בעת חתך קפל קול העכברוש במישור קורונל, הצמתים neuromuscular (NMJs) של ארבעה של שרירי השומן המהותיים ממוקמים בתוך פחות מ 1.8 מ"מ של עומק הרקמה11. לכן, ניטור מדויק של אנטומיה שריר שומן במהלך cryosectioning הוא הכרחי כדי לזהות במדויק את החלקים של עניין ולמנוע oversectioning של רקמות. יתר על המידה של שריר היעד יכול לגרום לזיהוי לא מדויק של מספר וטופוגרפיה של NMJs11 או יכול לגרום הפחתות כולל בגודל המדגם אם שריר היעד הוא מושלך עקב בלבול כיוון ציון דרך12. ככל שמפותחים מודלים חדשניים לחקר שרירי השומן וההתאמות שלהם, נהלי הפעלה סטנדרטיים חיוניים כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, אמינות ושחזוריות לאורך מחקרים.
מטרת מאמר זה היא לפרט את הכנת קפל קול החולדה לניתוח אורך וחתך אופטימלי. שיטות מפורטות המשמשות באופן קבוע במעבדה שלנו מתוארות לזהות ציוני דרך שריר היעד במהלך cryosectioning. למרות שיטות דומות משמשים במספר מעבדות, פרטים גדולים יותר מסופקים כאן מאשר בספרות כדי להבטיח שכפול אמין ומדויק כאשר מיושם על ידי חוקרים טירון. מטרת מדריך זה היא לספק מתודולוגיה סטנדרטית להערכה אימונוהיסטוכימית (IHC) של קפל קול החולדה כדי לשפר את העקביות במעבדות ובחקירות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק.
1. לנתח גרון עכברוש
- המתת חסד חולדה על פי הפרוטוקול שאושר במוסד. לגלח את הצוואר הגחוני מן הלסתן כדי manubrium וספוגית עם אלכוהול כדי למנוע זיהום פרווה בדגימות הרקמה.
- תחת טווח ניתוח עם הגדלה פי 10 excise הגרון כולו על ידי יצירת חתכת צוואר בינוני עם אזמל עד קנה הנשימה נחשף.
- הפרד את שרירי הגרון הגחון הקיצוני בקו האמצע כדי לחשוף את הגרון באמצעות מלקחיים ומספריים וניתוח או אזמל.
- נתק את קנה הנשימה לטבעת קנה הנשימה השלישית ובצע חתך בעצם הלשון כדי לחתוך את כל הגרון באמצעות מספריים ניתוח.
- הסר את רקמות הגרון הקיצוניות (ושט, בלוטת התריס ושרירי הגרון הקיצוניים) מהגרון באמצעות כלי מיקרו-חיתול (פינצטה, סיכות ומיקרו-רסיסים) תחת הגדלה.
- עם מיקרו-רסיסים, חצו את הגרון בין האירטנואידים באמצעות קו האמצע בין השרירים הקריקוריטנואידים האחוריים כציון דרך. הצמד קירות רוחביים של הגרון כדי לחשוף את קפלי הקול ולאחר מכן חוצה את קו האמצע של סחוס בלוטת התריס בין הזרם הזעיר של קפלי הקול עם מיקרו-סיסייזרים (איור 1).
הערה: שלב זה יכול להיות אופציונלי; ניתן לדלג עליו כדי לשמור על הגרון שלם. בייסקציה של גרון מאפשר טכניקות חיסוניות מרובות על ידי שימוש בנפרד בצד ימין ושמאל של אותו הגרון. - יש לשטוף כל גרון חמי בתמיסה חוצץ פוספט (PBS) למשך כ-10 מעלות ולייבש בעדינות עם מגב משימה להפחתת היווצרות גבישי הקרח במהלך ההקפאה.
2. לתקן ו/או להקפיא רקמת שומן
הערה: ייתכן שהתיבעון אינו אידיאלי עבור כל הפרוטוקולים החיסוניים. לעתים קרובות רקמות שומן קפואות מיד לאחר הניתוח. דלג על שלב 2.1 לרקמת שומן להקפאת הבזק ללא קיבעון.
- כדי לתקן hemi-larynges למקם רקמות בצינור צנטריפוגה מלא עם 4% פורמלדהיד ב PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד. מעבירים רקמות לצינור צנטריפוגה נקי ולשטוף פי 3 במשך 20 דקות ב-PBS. לאחר מכן להעביר צינור צנטריפוגה נקי ולשקוע בתמיסת 20% סוכרוז / 5% גליסול (~ 18 שעות או עד רקמות שוקע) ב 4 °C (4 °F).
אזהרה: פורמלדהיד מסוכן ויש להשתמש בו במכסה אדים יחד עם ציוד מגן אישי מתאים. - מניחים את כל שומן המי בתנוחה אחידה בתבנית הקפאה מלאה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). עבור hemilarynx, למקם את הרקמה עם המשטח המהודל של קפל הקול מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold. עבור שומן שלם, מניחים את הרקמה עם cricoarytenoids האחורי מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold.
הערה: אוריינטציה ריתנית עקבית בתוך תרכובת OCT היא קריטית עבור cryosectioning של קפל קול החולדה. ברגע המילרינקס מוטבע ומוקפא, יש להפשיר אותו כדי לשנות את הכיוון שלה, ובכך להציג סיכונים של נזק לרקמות ממחזורי הפשרה-הקפאה מרובים. - רקמות הקפאת פלאש באמצעות איזופנטן (2-מתילבוטן) מקורר בכוס פלדה מוקף חנקן נוזלי.
הערה: איזופנטן מגיע לטמפרטורה אופטימלית להקפאת רקמות כאשר משקעים לבנים מתחילים להיווצר בצדדים ובתחתית של 13. Isopentane משמש כי יש לו מוליכות תרמית גבוהה יותר מאשר חנקן נוזלי, אשר מסייע במניעת פיצוח של בלוק הרקמה במהלך הקפאה מהירה. לקבלת תיאור מפורט יותר של רקמה הקפואה ב- OTC עיין קומאר et al.13. - עוטפים כל תבנית בנייר כסף עם תווית מראש ומניחים בשקית מקפיא בודדת למניעת התייבשות ומאחסנים מיד על קרח יבש עד להעברתו לאחסון במקפיא של 80 מעלות צלזיוס.
3. המילרינקס קריוזקציה במישור חתך
- הגדר טמפרטורת החדר cryostat כדי -20 °C (5 °F), אשר באמצע טווח הטמפרטורה (15−25 °C (5 °F) מומלץ עבור חתך רקמת שריר על ידי המדריך של היצרן.
- הגדר עובי מקטע cryostat למקטעים בעובי 10 מיקרומטר.
הערה: לניתוח חתך סיבי שריר, חלקים בעובי 10 מיקרומטר אופטימליים כדי לאפשר כתמים מלאים ועוצמת הדמיה חזקה של סיבי השריר המסומנים לניתוח הקלדת סיבים14,15,16. פרוטוקולים מסוימים עשויים לדרוש עובי סעיף שונה בהתאם למטרות neuromuscular. - מעבירים רקמות לתא הקריוסטט, מוסיפים שכבה אחידה של תרכובת OCT בדיסק הדגימה הקריוסטט (צ'אק), ומניחים את בלוק הרקמה המוטמע על גבי תרכובת OCT בדיסק הדגימה. כדי לקבל חתכים צולבים של קפל הקול לניתוח סיבי שריר תירואריטנואידים (TA), הדביקו את הדגימה לצ'אק כך שסחוס בלוטת התריס הגחוני יעמוד מול להב הקריוסטט וסחוס האריטנואידים פונה לדיסק הדגימה.
הערה: חשוב לציין כי ציוני דרך אלה אינם נראים בשלב זה, בשל מתחם OCT הופך לבן ואטום כאשר קפוא. חוסר ראות זה הוא הסיבה לכך שזה קריטי לציין את הכיוון של המילרינקס במהלך שלב הקפאת הבזק. - לקצץ תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד החלק הגחון של הסחוס בלוטת התריס מופיע.
- לאחר מכן לקצץ ולעקוב אחר 30 μm קטעים מן תחילת הסחוס בלוטת התריס עד propria lamina, שרירי ת"א המהודל, ושריר ת"א לרוחב נחשפים.
הערה: יש לעקוב אחר ציוני דרך דמעות וציין מהתחלת סחוס בלוטת התריס כל 100 מיקרומטר כדי להבטיח את זווית החתך אינו אלמוני. איור 2 מייצג את שני סטים של ציוני דרך ים חתך במישור חתך בהגדלה של פי 10. - לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובי ב 10 מיקרומטר.
- יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה.
הערה: ניתן לאחסן רקמה קבועה ב- PBS עד שבוע בהתאם ליעד IHC ואילו רקמות לא מנומשות צריכות להיות מעובדות באופן מיידי.
4. המילארינקס קריוזקציה במישור אורך
- עם תא cryostat שוב להגדיר -20 °C (50 °F), לשנות את עובי המקטע ל 30 מיקרומטר.
הערה: עבור ניתוח NMJ, עובי רקמה בין 30−60 מיקרומטר יכול לשמש כדי ללכוד כמה NMJs שלמים בתוך שרירי השומן ללא פיצול של מסוף העצב או לוחית המנוע 11,12,17. - כדי להשיג מקטעי קיפול קולי אורך לניתוח NMJ של שריר ת"א, הדבק את הדגימות לצ'אק כך שהאפיגלוטיס מכוון לכיוון להב הקריוסטט ולומן קנה הנשימה פונה כלפי מטה לכיוון דיסק הדגימה.
- לקצץ את תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד הסחוס בלוטת התריס מופיע.
- לקצץ ולעקוב אחר קטעים של 30 מיקרומטר מהתנעה של בלוטת התריס עד propria למינה וחטיבות מדיאליות לרוחב של שריר ת"א נחשפים.
הערה: חמישה סטים של ציוני דרך שומן במישור האורך מומלץ לעקוב אחר התקדמות עומק הרקמות לכיוון שריר ת"א היעד. איור 3 מייצג את ציוני הדרך הרינגיים במישור האורך בהגדלה של פי 10. - לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובית ב 30 מיקרומטר.
- יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות הייצוגיות היו חלק מחקירה מתמשכת של ההשפעות של פעילות גופנית קולית על מערכת neuromuscular שומן. עשרים ותשע גברים פישר 344 / חום חולדות נורבגיה (12 בן 12 חודשים, 17 24 חודשים) נשקלו והומתו עם שאיפת CO2 ואחריו בית החזה הדו-צדדי.
ההליכים פעלו על פי הפרוטוקול המתואר לסימון NMJs וגודל סיבים של שרירי ת"א לרוחב ומיודל. המרחק בין ציוני דרך דמעות היה במישורים אורך וחתך באמצעות שרירי ים וסחוסים שמסביב כדי לקבוע התקדמות במהלך cryosectioning (טבלה 1). המעקב החל בהופעה הר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הכנת קפלי קול חולדה לניתוח עצבי-שרירי יכולה להוות אתגרים שונים. לא רק ששרירי השומן קטנים ומוקפים בסחוס, ובכך מקשים על חילוץ ישיר של שריר המטרה, נמצאה גם שונות גבוהה בין בעלי חיים בעומק ציוני דרך אנטומיים דמעות. עבור שריר פרוטוקול מישור חתך, קטעי קיפול קול שלם הופיעו בין 21−85 קטעים (10 מיקרומטר לכל קטע) לאחר המראה הראשוני של הסחוס בלוטת התריס הגחוני, שהוא לא מעט פחות מאשר 63−126 קטעים (35 מיקרומטר לכל סעיף) במישור האורך עבור פרוטוקולי ניתוח NMJ (טבלה 1).
השונות נרשמה במרחקים ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים F31DC017053-01A1 (לנל, PI) ו K23DC014517 (ג'ונסון, PI) מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-Methylbutane מוסמך | Fisher Chemical | 35514 | |
| רדיד אלומיניום | Fisherbrand | 1213101 | |
| Cryo Tongs SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 | |
| להבי Cryostat | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| תבניות בסיס חד פעמיות 15 מ"מ x 15 מ"מ | Thermo Scientific | 41-741 | |
| רפידות תחתונות חד פעמיות | Medline | 23-666-062 | |
| ערכת חיתוך | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Phosphate-Buffered | Salt Gibco | 14190136 | |
| Frozen Section Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ice Bucket | Bel-Art | ||
| Immunostain Moisture Chamber | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| מחזיקי מחטים | Assi | ASSI. B148 | |
| ספוגים לא ארוגים, 4 שכבות | מהיר רפואי | 9023 | |
| שייקר אורביטלי | Troemner | 02-217-987 | |
| עט | |||
| פאפ פרפורמלדהיד, 16% w/v aq. סולן., ללא מתנול | אלפא Aesar | 50-00-0 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה פרימיום | פישרברנד | 5408129 | |
| אחסון דגימות שקיות | Fisherbrand | 19240093 | |
| נירוסטה מידה מדורגת 32 אונקיות / 100 מ"ל | Polar Ware | 114231B | |
| Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| מגב משימות | Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| טיימר | Fisherbrand | 2261840 | |
| Vannas Pattern מספריים | אסי | ש"י. | |
| הערה: עבור כל האספקה, אלו הן דוגמאות לציוד לרכישה. המודל המדויק אינו הכרחי להשלמת השיטות שלנו. |
מקורות
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
