Этот протокол описывает методы, используемые для подготовки голосовых складок крыс к гистохимическому нервно-мышечному исследованию.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка голосовой складки крысы к нервно-мышечному анализу
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Целью этого урока является описание подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. В этом протоколе описываются процедуры рассечения гортани крыс, мгновенного замораживания и криосекции голосовых складок. В этом исследовании описывается, как проводить криосекцию голосовых складок как в продольной, так и в поперечной плоскостях. Новинкой этого протокола является отслеживание гортани во время криосекции, что обеспечивает точную идентификацию внутренних мышц гортани и снижает вероятность потери тканей. Рисунки демонстрируют прогрессивную криосечение в обеих плоскостях. Двадцать девять крысиных геми-ларингов были криосекциированы и отслежены от появления щитовидного хряща до появления первой секции, которая включала полную голосовую складку. Полная голосовая складка была визуализирована для всех животных в обоих плоскостях. Отмечалась высокая вариабельность расстояния от появления щитовидного хряща до появления полной голосовой складки в обеих плоскостях. Вес не коррелировал с глубиной гортанных ориентиров, предполагая, что индивидуальная изменчивость и другие факторы, связанные с подготовкой тканей, могут быть ответственны за высокую изменчивость внешнего вида ориентиров во время секционирования. Это исследование детализирует методологию и представляет морфологические данные для подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. Из-за высокой индивидуальной вариабельности ориентиры гортани должны тщательно отслеживаться во время криосекции, чтобы предотвратить пересечение ткани и потерю тканей. Использование последовательной методологии, включая адекватную подготовку тканей и осведомленность о ориентирах в гортани крысы, поможет получить последовательные результаты во всех исследованиях и поможет новым исследователям, заинтересованным в использовании голосовой складки крысы в качестве модели для изучения нервно-мышечных механизмов гортани.
Введение
Крысиная гортань является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования структурных и функциональных нервно-мышечных адаптаций гортани к развитию, старению, болезням и фармакологическим агентам1,2,3,4,5. Согласованность гистологических методов имеет решающее значение для этого направления работы, поскольку существует множество тонкостей, связанных с подготовкой и анализом мышц, а также проблемы, связанные с размером гортани, формой и топографией мышц, инкапсулированных в гортанных хрящах1,6,7,8,9,10,11 . Из-за небольшого размера внутренних мышц гортани крыс систематическое встраивание, замораживание и криосечение имеют решающее значение для достижения последовательных и точных результатов. Например, при разрезании голосовой складки крысы в корональной плоскости нервно-мышечные соединения (NMJ) четырех внутренних мышц гортани расположены в пределах менее 1,8 мм глубины ткани11. Поэтому точный мониторинг анатомии гортанных мышц во время криосекции необходим для точного определения интересующего участка (участков) и предотвращения чрезмерного разреза ткани. Чрезмерное вырезание целевой мышцы может привести к неточной идентификации числа и топографии NMJs11 или может привести к общему уменьшению размера выборки, если целевая мышца отброшена из-за путаницы ориентации ориентира12. По мере разработки новых моделей для изучения мышц гортани и их соответствующих адаптаций стандартные операционные процедуры необходимы для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости результатов во всех исследованиях.
Целью данной статьи является детальная подготовка голосовой складки крысы к оптимальному продольному и поперечному анализу. Описаны подробные методы, регулярно используемые в нашей лаборатории для выявления целевых мышечных ориентиров во время криосекции. Хотя подобные методы используются в нескольких лабораториях, здесь приводится более подробная информация, чем в литературе, чтобы обеспечить надежную и точную репликацию при внедрении начинающими исследователями. Целью этого учебника является предоставление стандартной методологии иммуногистохимической (IHC) оценки голосовой складки крыс для улучшения согласованности в лабораториях и исследованиях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было проведено в соответствии с Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинской школы Нью-Йоркского университета.
1. Рассечение гортани крысы
- Усыпляйте крыс в соответствии с институционально утвержденным протоколом. Сбрить вентральную шейку от нижней челюсти до манубриума и тампона спиртом, чтобы предотвратить загрязнение меха в образцах тканей.
- Под рассекающим прицелом с 10-кратным увеличением иссейте всю гортань, создав разрез шеи средней линии скальпелем до тех пор, пока трахея не обнажится.
- Отделите вентральные наружные гортанные мышцы по средней линии, чтобы обнажить гортань с помощью щипцов и рассекающих ножниц или скальпеля.
- Отрежьте каудальную трахею до третьего кольца трахеи и сделайте ростральный разрез к подъязычной кости, чтобы иссечь всю гортань с помощью рассекающих ножниц.
- Удалите наружные ткани гортани (пищевод, щитовидную железу и наружные гортанные мышцы) из гортани с помощью инструментов микродиссекции (пинцет, булавки и микросублицы) под увеличением.
- С помощью микроциссоров делят гортань пополам дорсально между аритеноидами, используя среднюю линию между задними крикоаритеноидными мышцами в качестве ориентира. Закрепите боковые стенки гортани, чтобы обнажить голосовые складки, а затем вентрально разделить пополам через среднюю линию щитовидного хряща между передней комиссурой голосовых складок с помощью микросублиц (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть необязательным; его можно пропустить, чтобы сохранить гортань целой. Бисекция ларингов допускает несколько методов иммуноокрашения путем раздельного использования правой и левой сторон одной и той же гортани. - Промыть каждую гемигортань в фосфатно-буферном растворе (PBS) в течение ~ 10 с и деликатно высушить с помощью рабочего стеклоочистителя, чтобы уменьшить образование кристаллов льда во время замораживания.
2. Зафиксируйте и/или заморозьте ткань гортани
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация может быть не идеальной для всех протоколов иммуноокрашения. Часто ткани гортани мгновенно замораживаются свежими сразу после рассечения. Пропустите шаг 2.1, чтобы мгновенно заморозить ткань гортани без фиксации.
- Для фиксации гемиларингов помещают ткани в центрифужную трубку, заполненную 4% формальдегидом в ПБС в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере при 70 об/мин. Переложите ткани в чистую центрифужную трубку и промойте 3 раза в течение 20 минут в PBS. Затем переложить в чистую центрифужную трубку и погрузить в 20% раствор сахарозы/5% глицерина (~18 ч или до тех пор, пока ткань не утонет) при 4 °C.
ВНИМАНИЕ: Формальдегид опасен и должен использоваться в вытяжном шкафу вместе с соответствующими средствами индивидуальной защиты. - Поместите все геми-ларинги в однородное положение в криоформу, заполненную компаундом оптимальной температуры резания (OCT). Для гемилярной глотки поместите ткань с медиальной поверхностью голосовой складки, обращенной к нижней части криомольда, и продольным аспектом голосовой складки параллельно нижнему краю отверстия криомольда. Для целых ларингов поместите ткань с задними крикоаритеноидами лицом к нижней части криомольда и продольным аспектом голосовой складки параллельно нижнему краю криомольдного отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательная ориентация гортани в соединении OCT имеет решающее значение для криосекции голосовой складки крысы. После того, как гемилярная глотка внедрена и заморожена, ее необходимо разморозить, чтобы изменить ее ориентацию, тем самым создавая риски повреждения тканей от нескольких циклов оттаивания-замораживания. - Ткани мгновенной заморозки с использованием изопентана (2-метилбутана) охлаждают в стальном стакане, окруженном жидким азотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изопентан достигает оптимальной температуры для замерзания тканей, когда белые осадки начинают образовываться по бокам и дну стакана13. Изопентан используется потому, что он имеет более высокую теплопроводность, чем жидкий азот, что помогает предотвратить растрескивание тканевого блока при быстром замораживании. Для более подробного описания замораживания тканей в безрецептурном режиме обратитесь к Kumar et al.13. - Заверните каждую форму в предварительно маркированную фольгу и поместите в индивидуальный морозильный мешок для предотвращения обезвоживания и немедленно храните на сухом льду до передачи для хранения в морозильной камере при температуре -80 °C.
3. Криосекция гемилярной глотки в плоскости поперечного сечения
- Установите температуру камеры в криостате на -20 °C, что находится в середине температурного диапазона (15−25 °C), рекомендованного для разрезания мышечной ткани руководством производителя.
- Установите толщину секции криостата на толщину 10 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа поперечного сечения мышечных волокон оптимальны срезы толщиной 10 мкм, чтобы обеспечить полное окрашивание и надежную интенсивность визуализации меченых мышечных волокон для анализа типирования волокон14,15,16. Некоторые протоколы могут требовать различной толщины сечения в зависимости от нервно-мышечных мишеней. - Перенесите ткани в криостатную камеру, добавьте однородный слой соединения OCT на диск образца криостата (патрон) и поместите встроенный блок тканей поверх соединения OCT на диск образца. Чтобы получить поперечные сечения голосовой складки для анализа тимеоаритеноидных (ТА) мышечных волокон, прикрепите образец к патрону так, чтобы вентральный щитовидный хрящ был обращен к лезвию криостата, а аритеноидный хрящ — к диску образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что эти ориентиры не видны на этом этапе из-за того, что соединение OCT становится белым и непрозрачным при замораживании. Это отсутствие видимости является причиной того, что важно отметить ориентацию гемилярной глотки во время стадии замораживания вспышки. - Обрежьте соединение OCT путем продвижения головки образца на 100 мкм до тех пор, пока не появится вентральная часть щитовидного хряща.
- Затем обрежьте и отслеживайте участки 30 мкм от начала щитовидного хряща до тех пор, пока не будут обнажены lamina propria, медиальные мышцы TA и боковая мышца TA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентиры гортани должны отслеживаться и отмечаться с самого начала щитовидного хряща каждые 100 мкм, чтобы угол сечения не был косым. На рисунке 2 представлены два набора ориентиров гортани в плоскости поперечного сечения при 10-кратном увеличении. - Как только целевая мышца ТА достигнута, соберите участки на положительно заряженных слайдах на 10 мкм.
- Храните срезы в PBS при температуре 4 °C, чтобы сохранить влагу до тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированная ткань может храниться в PBS до одной недели в зависимости от мишени IHC, тогда как нефиксированная ткань должна быть немедленно обработана.
4. Криосекция гемилярной глотки в продольной плоскости
- Когда криостатная камера снова установлена на -20 °C, измените толщину сечения на 30 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа NMJ толщина ткани между 30−60 мкм может быть использована для захвата нескольких полных NMJ в мышцах гортани без фрагментации ни нервного терминала, ни концевой пластины двигателя11,12,17. - Чтобы получить продольные участки голосовой складки для NMJ-анализа мышцы TA, прикрепите образцы к патрону так, чтобы надгортанник был ориентирован на лезвие криостата, а просвет трахеи обращен вниз к диску образца.
- Обрежьте соединение OCT, продвигая головку образца на 100 мкм до появления щитовидного хряща.
- Обрезка и отслеживание участков 30 мкм от начала щитовидной железы до обнажения ламины проприи и медиальных и боковых отделов мышцы ТА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пять наборов ориентиров гортани в продольной плоскости рекомендуются для отслеживания прогрессирования глубины ткани к целевой мышце ТА. На рисунке 3 представлены ориентиры гортани в продольной плоскости при 10-кратном увеличении. - Как только целевая мышца ТА достигнута, соберите участки на положительно заряженных слайдах на 30 мкм.
- Храните срезы в PBS при температуре 4 °C, чтобы сохранить влагу до тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные результаты были частью продолжающегося исследования влияния вокальных упражнений на нервно-мышечную систему гортани. Двадцать девять самцов крыс Fischer 344/brown Norway (12 9-месячных, 17 24-месячных) были взвешены и усыплены с вдыханием CO2 с последующей двусторонней торакотомией.
Процедуры следовали описанному протоколу для маркировки NMJ и размера волокон боковых и медиальных мышц TA. Расстояние между гортанными ориентирами отслеживалось как в продольной, так и ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Подготовка голосовых складок крыс к нервно-мышечному анализу может столкнуться с различными проблемами. Мало того, что гортанные мышцы малы и окружены хрящом, что затрудняет непосредственное извлечение мышц-мишеней, высокая изменчивость также была обнаружена между животными в глубине анатомических ориентиров гортани. Для протокола плоскости поперечного сечения мышц после первоначального появления вентрального тиреоидного хряща появились полные участки голосовой складки между 21−85 участками (10 мкм на сечение), что неско...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) и K23DC014517 (Johnson, PI) от Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-Метилбутан Сертифицированный | Fisher Chemical | 35514 | |
| Алюминиевая фольга | Fisherbrand | 1213101 | |
| Криощипцы SS | Thermo Scientific | 11679123 | |
| Криостат | Leica Biosystems | CM3050 | |
| Лезвия для криостата | C.L. Sturkey D554X50 | 22-210-045 | |
| Одноразовые формы основания 15мм x 15 мм | Thermo Scientific | 41-741 | |
| Одноразовые пеленки | Medline | 23-666-062 | |
| Набор для препарирования | Thermo Scientific | 9996969 | |
| DPBS - Dulbecco's Фосфатно-солевой буферный раствор | Gibco | 14190136 | |
| замороженной секции Medium | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Ведро для льда | Bel-Art | ||
| Увлажняющая камера с иммуноокрашиванием | Ted Pella Inc | NC9425474 | |
| иглодержатели | Assi | ASSI. B148 | |
| Губки нетканые, 4 слоя | Quick Medical | 9023 | |
| Орбитальный шейкер | Troemner | 02-217-987 | |
| Пап-ручка | |||
| Параформальдегид, 16% по мас., не содержит метанола | Alfa Aesar | 50-00-0 | |
| Микроцентрифужные пробирки премиум-класса | Fisherbrand | 5408129 | |
| хранения образцов Сумки | Fisherbrand | 19240093 | |
| Нержавеющая сталь Градуированная мера 32 унции/100 мл | Полярная посуда | 114231B | |
| Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопа | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Стеклоочиститель | задач Kimberly-Clark Professional™ 34155 | 06666A | |
| Таймер | Fisherbrand | 2261840 | |
| шаблон ваннас Ножницы | Assi | ASSI. | |
| ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех расходных материалов это примеры оборудования для покупки. Точная модель не является обязательной для завершения наших методов. |
Ссылки
- Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).
- Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).
- Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
- Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
- Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
- Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
- Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
- Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
- Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
- Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).
- McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
- McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
- Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
- Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
