许多细菌利用鞭毛驱动的运动能力来在环境中移动，并单独或集体定植于有利的环境。本文展示了三种成熟方法的应用，这些方法利用运动性作为筛选工具，以鉴定参与游泳和群集运动的组分或通路。
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本文内容
摘要
摘要
运动性对许多细菌物种的生存和成功至关重要。目前已有多种方法可利用细菌运动性来研究信号通路、阐明鞭毛组分的功能与组装机制，以及观察和理解其运动模式。本文展示了其中三种方法的结合应用。软琼脂中的运动性检测是最经典的方法，能够有效筛选出在运动缺陷菌株中恢复运动能力的获得功能型抑制突变，即通过第二次突变恢复运动性。细胞锚定技术最初用于证明鞭毛马达的旋转特性，现可用于评估信号效应分子对马达转速及其切换旋转方向能力的影响。“边界穿越”实验则是较新的方法，可使游动细菌被诱导转变为群体性迁移的群集运动状态。这三种方法联合使用，构成了一套系统而强大的策略，可用于鉴定运动装置的组成成分，并表征它们在游泳和群集运动不同层面中的作用。这些方法也可轻松地推广应用于其他细菌物种的运动性研究。
引言
细菌利用多种附属结构在其生态位中进行运动和扩散1。其中，鞭毛驱动的运动速度最快，能够响应环境信号促进细菌向有利环境定植，并显著增强某些物种的致病能力2,3。具有鞭毛的细菌可在液体环境中独立游动，或在半固体表面以群体形式协同迁移4。细胞外的鞭毛通过嵌入膜内的旋转马达进行附着和驱动，该马达利用离子梯度产生的能量产生转矩，从而驱动鞭毛旋转1,2,4,5,6,7,8。在E. coli中，其马达以恒定转矩运行9，马达输出可通过旋转速度以及转子在逆时针（CCW）和顺时针（CW）方向之间的切换来表征。CCW旋转促进形成协调的鞭毛束，推动细胞向前运动（“run”），而短暂的方向切换（CW）则导致鞭毛束部分或完全解....
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方案
1. 运动缺陷型菌株中抑制突变体的分离
注意：将此方法作为广泛的“通用检测”手段，用于确定运动缺陷的一般性质。
- 软琼脂平板制备
注意：软琼脂（也称为运动性琼脂或泳动琼脂）是一种低浓度琼脂（约0.2–0.35% w/v），长期以来用于趋化性检测31,32。- 在2 L的圆底烧瓶中加入3 g细菌琼脂（0.3% w/v）和20 g LB培养基。向烧瓶中加入1 L去离子水（ddH2O），使用搅拌棒和磁力搅拌器均匀混合悬浮液。
- 在121 °C下高压灭菌20分钟。
- 用上述搅拌棒和磁力搅拌板轻轻搅动使其冷却。当温度降至约50 °C时，将25 mL液体倒入无菌培养皿（100 mm × 15 mm）中，盖上皿盖静置至少1小时，使琼脂凝固，制备好的平板应在16小时内使用。
- 菌种培养、接种及抑制突变体的分离
注意：E. coli在以软琼脂固化的营养丰富培养基中心接种后，会在局部消耗营养物质，形成细菌可追随的营养梯度。随着细菌向外移动，会出现明确的“环状”区域（图1A
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结果
在假回复突变体的分离中 E. coli 在我们实验室近期的研究中，详细描述了一种由于信号分子 c-di-GMP 水平过高而导致运动能力受损的菌株34该菌株（JP1442）含有两个突变：ΔyhjH 和 ΔycgRYhjH 是降解 c-di-GMP 活性最强的磷酸二酯酶 E. coliYhjH缺失导致c-di-GMP水平升高并抑制运动性。YcgR是一种c-di-GMP效应蛋白。当与c-di-GMP结合时，YcgR可结合至鞭毛转子，首先诱导逆时针（CCW）电机旋转，随后降低电机转速。细胞拴系实验和微珠实验证实，在双突变体中电机行为恢复至正常水平，但在软琼脂中的运动性并未恢复。34因此，我们采用该方案的第1步，在双突变体中分离假回复子簇图1C）。通过全基因组测序（HiSeq 4000 平台，PE 2 x 150 配置）定位的大多数突变34) 到 rssB，.......
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讨论
分离和鉴定抑制性突变已成功帮助识别趋化系统中的关键组分35,36,37，以及运动装置本身38,39,40。在使用方案1时，应包含多个独立的重复实验，以确保能够分离出大量可能补偿运动缺陷的突变。通过将菌液划线接种而非点种，增加细菌数量，可提高获得抑制性突变体的概率41。同一突变（通过DNA测序确定）被多次独立分离，可增强其真实性的可信度。全基因组测序（WGS）不可避免地会揭示基因组中存在其他突变，因此，通过转导（如可行）将鉴定出的突变回置到原始的运动缺陷型背景中以验证结果至关重要。抑制性突变体方法依赖于通过二次突变恢复功能，因此该方法的一个局限性在于：如果某个关键的结构基因被完全删除（即该基因是整个通路或结构的基础），则可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院资助项目 GM118085 以及罗伯特·韦尔奇基金会（资助号 F-1811，授予 R.M.H.）的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Bacto 脱水琼脂 | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | |
| EDTA 二钠盐，二水合物 | Fisher Scientific | 02-002-786 | |
| Eiken 琼脂 | Eiken Chemical Co. Japan | E-MJ00 | 大肠杆菌群集运动所必需 |
| 葡萄糖 D (+) | Fisher Scientific | 410955000 | |
| LB（Lennox）肉汤 | Fisher Scientific | BP1427-500 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液（0.1%） | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 氯化钾（KCl） | Fisher Scientific | 18-605-496 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | S271-500 | |
| 材料与设备 | |||
| CellSense 显微镜成像软件（V. 1.6） | Olympus | 或所用显微镜的等效软件 | |
| Electron Microscopy Sciences Scotch 666 双面胶带 | Fisher | 50-285-28 | |
| 磨砂载玻片（3×1×1 mm） | Fisher | 12-550-343 | |
| Olympus BX53 显微镜 | Olympus | BX53 | 任何正置或倒置相差显微镜均可使用 |
| 培养皿（100 mm 直径） | Fisher Scientific | FB0875712 | 用于软琼脂实验 |
| 聚乙烯雾化毛细管（0.58 mm × 99 mm，3.0 m） | Perkin Elmer | 9908265 | |
| 双区圆形培养皿 | VWR | 89200-944 | 用于边界跨越实验 |
| 安全型皮下注射针头（23G） | Fisher Scientific | 14-826A | |
| 无菌注射器 - 1 mL | Fisher scientific | 14-955-450 | |
| Task/Tissue 擦拭纸 | Fisher scientific | 06-666 | 或等效的一次性擦拭纸 |
| VWR 显微盖玻片（18×18 mm） | VWR | 48366205 | |
| XM10 相机 | Olympus | XM10 | 或等效显微镜相机 |
参考文献
- Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
- Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57
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