We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Genexpressieanalyse van menselijk nierweefsel is een belangrijk hulpmiddel om homeostase en ziektepathofysiologie te begrijpen. Het verhogen van de resolutie en diepte van deze technologie en het uitbreiden ervan tot het niveau van cellen in het weefsel is nodig. Hoewel het gebruik van single nuclear en single cell RNA sequencing wijdverspreid is geworden, behouden de expressiehandtekeningen van cellen verkregen uit weefseldissociatie geen ruimtelijke context. Lasermicrodissectie (LMD) op basis van specifieke fluorescerende markers zou de isolatie van specifieke structuren en celgroepen van belang met bekende lokalisatie mogelijk maken, waardoor ruimtelijk verankerde transcriptomische handtekeningen in nierweefsel kunnen worden verwerving. We hebben een LMD-methodologie geoptimaliseerd, geleid door een op fluorescentie gebaseerde vlek, om vijf verschillende compartimenten in de menselijke nier te isoleren en daaropvolgende RNA-sequencing uit waardevolle menselijke nierweefselmonsters te geleiden. We presenteren ook kwaliteitscontroleparameters om de toereikendheid van de verzamelde specimens te kunnen beoordelen. De workflow die in dit manuscript wordt beschreven, toont de haalbaarheid van deze aanpak om subsegmentale transcriptomische handtekeningen met veel vertrouwen te isoleren. De hier gepresenteerde methodologische benadering kan ook worden toegepast op andere weefseltypen met vervanging van relevante antilichaammarkers.
Inleiding
Technologische vooruitgang bij het bestuderen van weefselmonsters heeft het begrip van de gezondheidstoestand en ziekte in verschillende organen verbeterd. Dergelijke vooruitgang heeft onderstreept dat pathologie kan beginnen in beperkte regio's of in specifieke celtypen, maar toch belangrijke implicaties heeft voor het hele orgaan. Daarom is het in het huidige tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde belangrijk om de biologie op zowel cel- als regionaal niveau te begrijpen en niet alleen wereldwijd1. Dit geldt met name voor de nier, die bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen en structuren die differentieel initiëren en/of reageren....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De studie werd goedgekeurd voor gebruik door de Institutional Review Board (IRB) van de Indiana University.
OPMERKING: Gebruik dit protocol met niernefrectomieweefsel (tot 2 cm in zowel de X- als de Y-afmetingen) dat bewaard is gebleven in de optimal cutting temperature (OCT) verbinding en bewaard bij -80 °C. Voer al het werk uit op een manier die RNA-vervuiling beperkt, gebruik schone wegwerphandschoenen en een gezichtsmasker. Zorg voor de netheid van alle oppervlakken. De apparatuur waarvoor dit protocol is geoptimaliseerd, is een lasermicrodissectiesysteem met gepulseerde UV-laser.
1. Cryosectioning
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Monsters
We presenteren gegevens van negen referentie nefrectomieën (3 exemplaren verkregen aan de Indiana University en 6 specimens verkregen via Kidney Precision Medicine Project), gebruikmakend van het rapid fluorescence kleuringsprotocol om niernefronsegmenten en interstitiële gebieden te isoleren. De secties die in dit proces werden gebruikt, werden verkregen van overleden nierdonoren of niet-aangetaste tumornectectomie. Deze monsters hadden geen pathologisch bewijs van z.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Transcriptomics op basis van LMD is een nuttige technologie die genexpressie verankert naar specifieke gebieden in het weefsel. De basis van deze technologie en de mogelijke toepassing ervan in de nier is eerder beschreven8. Optimalisatie, modernisering en stroomlijning van fluorescentie-gebaseerde dissectie specifiek gericht op hoge nauwkeurigheid dissectie voor downstream RNA sequencing is echter minder alomtegenwoordig. Omdat deze methodologie ruimtelijk geaard is in het weefsel, heeft het het .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Algemeen: De auteurs willen de onderzoekers van het Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) bedanken voor hun gracieuze steun en advies.
Financiering: De NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) heeft dit werk ondersteund; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Onderzoek in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), onder awardnummer U2CDK114886.
Beschikbaarheid van gegevens en materialen: Gegevens worden gearc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD-buffer is inbegrepen in het pakket |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antilichaam | Abcam | ab76969 | Direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge buizen | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscoop camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Vrij) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolatie Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membraan slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Referentie Totaal RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Totaal RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq of NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Totaal RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Eiwit Antilichaam | R&D Systems | AF5144 | Direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referenties
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analy....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
