يسمح بروتوكول تصوير الخلايا البكتيرية الحية هذا بالتصور للتفاعلات بين أنواع بكتيرية متعددة على مستوى الخلية الواحدة بمرور الوقت. يسمح التصوير الفاصل الزمني بمراقبة كل نوع بكتيري في زراعة أحادية أو تربية نقّاء لاستجواب التفاعلات بين الأنواع في المجتمعات الجرثومية متعددة الأنواع، بما في ذلك حركية الخلايا الفردية وقابلية البقاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصور الحركي لتفاعلات البكتيريا بين الخلايا المفردة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المجتمعات متعددة الميكروبات في كل مكان في الطبيعة، ولكن دراسة تفاعلاتها على مستوى الخلية الواحدة أمر صعب. وهكذا، تم تطوير طريقة تستند إلى المجهر لمراقبة التفاعلات بين الأنواع بين اثنين من مسببات الأمراض البكتيرية. استخدام هذه الطريقة لاستجواب التفاعلات بين مسببات المرض الغرام السالبة، Pseudomonas aeruginosa وغير motile الغرام إيجابية الممرض، هو موضح هنا. يتكون هذا البروتوكول من التلقيح المشترك لكل نوع بين غطاء ومنصة agarose ، والتي تحافظ على الخلايا في مستوى واحد ويسمح بالتصور من السلوكيات البكتيرية في كل من المكان والزمان.
وعلاوة على ذلك، فإن المجهر الفاصل الزمني الذي يظهر هنا مثالي لتصور التفاعلات المبكرة التي تحدث بين نوعين أو أكثر من الأنواع البكتيرية، بما في ذلك التغيرات في حركة الأنواع البكتيرية في الزراعة الأحادية وتربية الأحياء مع الأنواع الأخرى. نظرا لطبيعة مساحة العينة المحدودة في إعداد المجهر، وهذا البروتوكول هو أقل قابلية للتطبيق لدراسة التفاعلات في وقت لاحق بين الأنواع البكتيرية مرة واحدة في مجموعات الخلايا مرتفعة جدا. ومع ذلك ، هناك العديد من التطبيقات المختلفة للبروتوكول والتي تشمل استخدام تلطيخ لتصوير الخلايا البكتيرية الحية والميتة ، وتحديد كمي من الجينات أو البروتين التعبير من خلال المراسلين الفلورسنت ، وتتبع حركة الخلايا البكتيرية في كل من الأنواع الفردية وتجارب متعددة الأنواع.
المقدمة
المجتمعات متعددة الميكروبات شائعة في الطبيعة، وتمتد على مجموعة متنوعة من البيئية1و2و3 و المنافذ البشرية4،5. بعض من التهابات بوليكروبات الأكثر شهرة في الأمراض البشرية وتشمل الأغشية الحيوية الأسنان6, الجروح المزمنة7,8, والتهابات الجهاز التنفسي في الأفراد الذين يعانون من مرض الانسداد الرئوي المزمن9, التنفس الصناعي المرتبطة الالتهاب الرئوي10, والتليف الكيسي المرض الوراثي (CF)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يمكن العثور على وصف كامل وأرقام الكتالوج لكافة الإمدادات في هذا البروتوكول في جدول المواد.
1. إعداد وسائل الإعلام M8T الحد الأدنى
- إعداد 1 L من M8 الحد الأدنى من قاعدة الأملاح (5x) عن طريق حل 64 غرام مننا 2HPO4·7H2O, 15 غرام من KH2PO4,و 2.5 ز ناول في 800 مل من الماء فائقة الخطورة (UPW, resistivity 18 MΩ/سم) في زجاجة 2 لتر. إلى 7.6 pH. حجم كامل إلى 1 L مع UPW. أوتوكلاف لمدة 45 دقيقة.
- إعداد 500 مل من محلول الجلوكوز (20٪ ث / الخامس) عن طريق حل 100 غرام من الجلوكوز في 400 مل من UPW في زجاجة 1 لتر. حل كامل ل500 مل مع UPW. أوتوكلاف لمدة 45 دقيقة.
- إعداد 500....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سيؤدي الاستخدام الناجح للأسلوب الموصوف إلى سلسلة من الإطارات التي تولد فيديو يمكن فيه ملاحظة التفاعلات بين الأنواع بمرور الوقت. التخطيطي في الشكل 1 يوفر مرئيا لتسليط الضوء على الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها إعداد المواد للتصوير. وقد سمح استخدام هذه الطريقة مظاهرة من الخلايا Aeruginosa P. عرض سلوكيات مختلفة في أحادية الثقافة مقابل في تربية الأحياء مع S. aureus. بالمقارنة مع الخلايا P. aeruginosa في أحادية الثقافة التي لا تزال مجمعة في الطوافات، عندما في تربية الأ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصف الأساليب المعروضة هنا بروتوكولاً للتصوير بالخلايا الحية لتفاعلات الأنواع البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة مع تعديلات لتطبيقات أخرى بما في ذلك تتبع الخلايا ومراقبة صلاحية الخلايا. هذه الطريقة تفتح آفاقا جديدة لدراسة السلوكيات وحيدة الخلية من الكائنات الحية الدقيقة في تربية الأحياء مع الأنواع الأخرى مع مرور الوقت. وعلى وجه التحديد، يوضح البروتوكول فائدة طريقة الاستزراع المشترك هذه في مراقبة سلوكيات السطح البكتيرية، خاصة عند دراسة الكائنات الحية التي لها كل من الزوائد المرتبطة بالسطح والسائل للحركية. على سبيل المثال، .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة التليف الكيسي ما بعد الدكتوراه إلى كلية انتقال جائزة ليمولي18F5 (DHL)، والتليف الكيسي مؤسسة صغار أعضاء هيئة التدريس جائزة التوظيف LIMOLI19R3 (DHL)، وNIH T32 منحة التدريب 5T32HL007638-34 (ASP). نشكر جيفري مايسنر، مينسو كيم، وإيثان غارنر على مشاركة البروتوكولات الأولية والمشورة للتصوير وصنع منصات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > وسادات الاغاروز < / قوي > | |||
| 35 مم طبق سفلي زجاجي مع 20 مم بئر صغير # 1.5 غطاء زجاجي | Cellvis | D35-20-1.5-N | واحد لقوالب وسادة الاغاروز ، واحد للتجربة |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG / Lonza | 50081 | لصنع وسادات |
| الاغاروزملاعق مستديرة | VWR | 82027-492 | |
| ملاعق مستديرة مدببة | VWR | 82027-530 | |
| عوازل السيليكون ، اضغط للختم ، 1 بئر ، قطر D 2.0 مم 20 مم ، سيليكون / لاصق | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | لقوالب وسادة الاغاروز |
| ألواح بتري معقمة ، 85 مم | Kord-Valmark / تباع بواسطة RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| <قوي>M8T الحد الأدنى من الوسائط< / قوي> | |||
| D (+) الجلوكوز | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| المجهر | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | الكاميرا. 4.2 ميجابيكسل sCMOS بإضاءة الخلف, 11 & mu; m بكسل ، 95٪ QE ، 48 إطارا في الثانية ، USB 3.0 ، F-mount. |
| مكعب تصفية GFP | نيكون | 96372 | تصفية |
| TxRed | نيكون | 96375 | مكعب مرشح |
| H201-NIKON-TI-S-ER | حاضنة Okolab | 77057447 | Stagetop |
| نيكون NIS-Elements AR مع تتبع GA3 و 2D و 3D برنامج | نيكون | 77010609 و MQS43110 و 77010603 و MQS42950 | لتحليل البيانات |
| نيكون Ti2 Eclipse | نيكون | نموذج Ti2-E | المجهر |
| CFI Plan Apo &# 411; الهدف 20x (0.75NA) | نيكون | MRD00205 | الهدف |
| CFI Plan Apo ƛ 100x زيت Ph3 DM الهدف (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | |
| Objective ThermoBox مع سخانات مروحة مدمجة | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | الضميمة |
| <قوية > سلالات بكتيرية< / قوية > | |||
| Pseudomonas aeruginosa < / em> PA14 (WT) | PMID: 7604262 | البروتوتروف | |
| غير المخاطيPseudomonas aeruginosa< / em> PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP< / em>) PMID | : 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa< em> PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2< / em> | PMID: 26041805 | ||
| المكورات العنقودية الذهبية< / em> USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin سلالة مقاومة LAC بدون بلازميدات | |
| المكورات العنقودية الذهبية< / em> USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP< / em>) PMID | : 20829608 | ||
| المكورات العنقودية الذهبية< / em> USA300 LAC &# 916; agrBDCA< / em> | PMID: 31713513 | ||
| <قوي>بقعة الجدوى< قوي> | |||
| بروبيديوم يوديد | Invitrogen | L7012 | مباشر / ميت & التجارة ؛ باكلايت & تجارة; طقم بقاء البكتيريا |
المراجع
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
- Cursino, L., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
