이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.
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방법 논문
단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
다편성 지역 사회는 본질적으로 유비쿼터스, 그러나 단 세포 수준에서 그들의 상호 작용을 공부하는 것은 어렵습니다. 따라서, 현미경-시경법-두 세균성 병원체 간의 종 간 상호 작용을 관찰하기 위한 개발되었다. 이 방법의 사용은 운동성 그램 음성 병원체, 슈도모나스 아에루기노사 및 비 운동성 그램 양성 병원체, 황색포도상구균 사이의 상호 작용을 심문하는 것으로 여기에서 입증된다. 이 프로토콜은 단일 평면에서 세포를 유지하고 공간과 시간 모두에서 세균 성 행동을 시각화 할 수있는 커버 슬립과 아가로즈 패드 사이의 각 종을 공동 접종으로 구성됩니다.
더욱이, 여기에서 입증된 시간 경과 현미경 검사는 단배와 다른 종과의 공존에 있는 세균성 종 운동성의 변경을 포함하여 2개 이상의 세균성 종 사이에서 일어나는 초기 상호 작용을 시각화하는 데 이상적입니다. 현미경 설정에 있는 제한된 견본 공간의 특성 때문에, 이 프로토콜은 세포 인구가 너무 높으면 세균성 종 사이 나중에 상호 작용을 공부하기 위하여 보다 적게 적용됩니다. 그러나, 살아있는 세균세포를 화상 진찰하기 위한 염색의 사용, 형광 기자를 통한 유전자 또는 단백질 발현의 정량화, 단일 종 및 다종 실험 모두에서 세균세포 움직임을 추적하는 프로토콜의 몇몇 다른 응용이 있다.
서론
다편균 공동체는 자연에서 흔히 볼 수 있으며, 다양한 환경1,,2,,3 및 인간틈새4,5에걸쳐 있습니다. 인간 질환에서 가장 악명 높은 폴리균 감염 중 일부는 만성 폐쇄성 폐질환9,환기기 관련폐렴(10),및,유전질환 낭포성 섬유증(CF)11,12를가진 개인의 치과용 생물막6,만성 상처7,8,호흡기 감염등을포함한다. 이 감염은 수시로 다양한 미생물 종으로 이루어질 것입니다; 그러나, 그람 양성 박테리아 황색포도상구균과 그람 음성 박테리아 슈도모나스 aeruginosa 사이 상호 작용에 최근 초점이 나타났습니다. 이러한 유기체와 시험관 내 분석에....
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프로토콜
참고: 이 프로토콜의 모든 소모품에 대한 전체 설명 및 카탈로그 번호는 재료 표에서 찾을 수 있습니다.
1. M8T 최소 미디어 준비
- 2L병에 는 Na2HPO4·7H 2 O 15g, KH2PO415g, 800mL의 2.5g NaCl을 2L 병에 녹여 M8 최소 염베이스(5배)의 L 1L을 준비한다.2 pH에서 7.6까지. UPW를 사용하여 1 L에 볼륨을 완성하십시오. 45분 동안 오토클레이브.
- 1 L 병에 UPW의 400 mL에서 포도당 100 g을 용해하여 포도당 용액 500mL (20 % w /v)를 준비하십시오. UPW를 사용하여 500 mL에 완벽한 솔루션. 45분 동안 오토클레이브.
- UPW의 400mL에서 트립톤 100g을 용해하여 트립톤 용액 500mL(20%w/v)를 준비합니다. UPW로 500mL로 완료하십시오. 45분 동안 오토클레이브.
- M8 + 10% 트라이프톤(M8T) 최소 미디어 1L을 5x M8 최소 염(1x 결승), 20% 포도당 10mL(0.2% 결승), 1mL 1mL(1mM MM 결승), 20% 50mL(최종 1mM 최종) 60mL(최종 1%)를....
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결과
설명된 방법을 성공적으로 사용하면 시간이 지남에 따라 종 간 상호 작용을 관찰할 수 있는 비디오를 생성하는 일련의 프레임이 생성됩니다. 도 1의 회로도는 이미징을 위한 재료 준비와 관련된 주요 단계를 강조하는 시각적 개체를 제공합니다. 이 방법의 사용은 S. 아우레우스와의 공동 문화에서 대 단문화에서 다른 행동을 나타내는 P. aeruginosa 세포의 데모를 허용했습니다. 뗏목에서 그룹화된 단배식의 P. 아루기노사 세포와 비교하여, S. 아우레우스와공존할 때, P. aeruginosa는 S. 아우레우스 콜로니(그림2A-2B)를향한 단세포 운동성을 증가시켰습니다.Figure 2A 형광으로 표지된 세균균은 또한 세균종의 혼합 된 인구를 시각화 할 수 있습니다. GFP 라벨P. aeruginos.......
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토론
여기에 제시된 방법은 세포 추적 및 감시 세포 생존가능성을 포함하여 그밖 응용을 위한 수정을 가진 단세포 수준에서 세균성 종 상호 작용의 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 다른 종과 공존하는 미생물의 단일 세포 행동을 연구하기위한 새로운 길을 열어줍니다. 특히, 이 프로토콜은 특히 운동성 표면 및 액체 관련 부속물을 모두 갖는 유기체를 연구할 때 세균 표면 거동을 관찰하는 이 동배 방법의 유용성을 보여줍니다. 예를 들어, 단일 초점 평면에서 세균 운동을 표면으로 제한함으로써, S. 아우레우스에 대한 응답으로 P. aeruginosa의 증가및 방향 성 필리 매개 운동성을 시각화할 수 있다.
앞서 언급했듯이, 이 이미징 방법을 사용하여 최적의 결과를 얻으려면 샘플 및 이미징 기기의 온도 및 습도(즉, 목표 및 단계)를 포함한 여러 조건을 고려해야 합니다. 더 많은 팁과 문제 해결을 보려면
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 낭포성 섬유증 재단 포스트독 -교부 전환 상 LIMOLI18F5 (DHL), 낭포성 섬유증 재단 주니어 교수 모집 상 LIMOLI19R3 (DHL), NIH T32 교육 보조금 5T32HL007638-34 (ASP)의 자금 지원을 받았습니다. 제프리 마이스너, 김민수, 에단 가너에게 영상과 패드 제작에 대한 초기 프로토콜과 조언을 공유해 주신 것에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로스 패드 | |||
| 35mm 유리 바닥 접시, 20mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리 | Cellvis | D35-20-1.5-N | 아가로스 패드 몰드용 1개, 실험용 1개 |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| 저용융 아가로스 | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | 아가로스 패드 |
| 제조용라운드 바텀 주걱 | VWR | 82027-492 | |
| 라운드 테이퍼 주걱 | VWR | 82027-530 | |
| 실리콘 아이솔레이터, 프레스 투 씰, 1 웰, D 직경 2.0 mm 20 mm, 실리콘 / 접착제 | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | 아가로 스 패드 몰드 |
| 멸균 페트리 플레이트, 85 mm | Kord-Valmark / RPI | 2900 | |
| 핀셋 | VWR | 89259-944로 판매 | |
| M8T 최소 매체 | |||
| D (+) 포도당 | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| 현미경 | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | 카메라.4.2 메가 픽셀 이면조사형 sCMOS, 11 μ m 픽셀, 95% QE, 48fps, USB 3.0, F-마운트. |
| 필터 큐브 GFP | Nikon | 96372 | 필터 |
| 큐브 필터 큐브 TxRed | Nikon | 96375 | 필터 큐브 |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | 무대 상단 인큐베이터 |
| GA3 및 2D 및 3D 추적 기능이 있는 Nikon NIS-Elements AR | 데이터 분석용 | 77010609, MQS43110, 77010603 MQS42950 | |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | 모델 Ti2-E | 현미경 |
| CFI Plan Apo ƛ 20x 객관적 (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | 객관적 |
| CFI 계획 Apo ƛ 100x 오일 Ph3 DM 대물렌즈(1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| 녹농균><녹농균 PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441녹 | ||
| >녹농균<> PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: | ||
| 포도상구균 아우레우스 USA300 LAC (WT) | PMID: | 23404398 USA300 CA-메티실린 내성 균주 LAC 플라스미드 없음 | |
| 황색포도상구균 USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| 포도상구균 USA300 LAC Δ agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight&트레이드; 박테리아 생존도 키트 |
참고문헌
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
- Cursino, L., et al.
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