Кинетическая визуализация одноклеточных межвидовые бактериальные взаимодействия

Kaitlin  D Yarrington; Andrea Sánchez Peña; Dominique  H Limoli

doi:10.3791/61376

Method Article

Кинетическая визуализация одноклеточных межвидовые бактериальные взаимодействия

DOI:

10.3791/61376

⸱

August 5th, 2020

Kaitlin D Yarrington*¹ , Andrea Sánchez Peña*¹ , Dominique H Limoli¹

¹Department of Microbiology and Immunology, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол визуализации живых бактериальных клеток позволяет визуализировать взаимодействия между несколькими бактериальными видами на одноклеточном уровне с течением времени. Промежуток времени визуализации позволяет для наблюдения каждого бактериального вида в монокультуре или кокультуры для допроса межвидовые взаимодействия в многовидовом бактериальных сообществ, в том числе отдельных клеток подвижности и жизнеспособности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимикробные сообщества широко распространены в природе, однако изучение их взаимодействия на одноклеточном уровне затруднено. Так, был разработан метод на основе микроскопии для наблюдения за межвидовыми взаимодействиями между двумя бактериальными патогенами. Здесь продемонстрировано использование этого метода для допроса взаимодействий между пестрым грам-отрицательным патогеном Pseudomonas aeruginosa и немостойким грамположительно-положительным патогеном, золотистым стафилококком. Этот протокол состоит из совместного инокуляции каждого вида между крышкой и агарозной площадкой, которая поддерживает клетки в одной плоскости и позволяет визуализировать бактериальное поведение как в пространстве, так и во времени.

Кроме того, продемонстрирована здесь промежуток времени микроскопия идеально подходит для визуализации ранних взаимодействий, которые происходят между двумя или более бактериальных видов, в том числе изменения в подвижности бактериальных видов в монокультуре и в совместной культуре с другими видами. Из-за характера ограниченного пространства образца в установке микроскопии, этот протокол менее применим для изучения более поздних взаимодействий между бактериальными видами, как только популяции клеток слишком высоки. Тем не менее, Есть несколько различных применений протокола, которые включают в себя использование окрашивания для визуализации живых и мертвых бактериальных клеток, количественная оценка гена или экспрессии белка через флуоресцентные репортеры, и отслеживание движения бактериальных клеток в обоих отдельных видов и многовидовых экспериментов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полимикробные сообщества распространены в природе,^{охватывающих различные экологические 1,}^,^2,^,³ и^{человеческие ниши 4,}^,^5. Некоторые из самых известных полимикробных инфекций в болезни^{человека включают стоматологические биопленки 6},^{хронические раны 7}^,⁸, и респираторных инфекций у лиц с хронической^{обструктивной болезнью легких 9}, аппарат^{искусственной вентиляции легких пневмонии 10}, и генетичес....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Полное описание и номера каталогов для всех материалов в этом протоколе можно найти в таблице материалов.

1. Подготовка минимальных средств массовой информации M8T

Приготовьте 1 л минимальной соляной базы M8 (5x) путем растворения 64 г Na₂HPO_{4 7H}₂O, 15 г KH₂PO₄и 2,5 г NaCl в 800 мл ультрачистой воды (UPW, резистория 18 МЗ/см) в бутылке 2 л. рН до 7,6. Полный объем до 1 л с UPW. Автоклав за 45 мин.
Приготовьте 500 мл раствора глюкозы (20% ж/в) путем растворения 100 г глюкозы в 400 мл UPW в бутылке 1 л. Полное решение до 500 мл с UPW. Автоклав за 45 мин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное использование описанного метода приведет к серии кадров, которые генерируют видео, в котором межвидовые взаимодействия могут наблюдаться с течением времени. Схема на рисунке 1 обеспечивает визуальный выделить ключевые шаги, связанные с подготовкой материалов для изображений. Использование этого метода позволило продемонстрировали P. aeruginosa клетки, проявляли различное поведение в монокультуре по сравнению с в совместной культуре с S. aureus. По сравнению с к.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные здесь методы описывают протокол для живоклеточной визуализации взаимодействий бактериальных видов на одноклеточном уровне с модификациями для других приложений, включая отслеживание клеток и мониторинг жизнеспособности клеток. Этот метод открывает новые возможности для изучения одноклеточного поведения микроорганизмов в совместной культуре с другими видами с течением времени. В частности, протокол демонстрирует полезность этого метода совместной культуры в наблюдении за поведением бактериальной поверхности.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что им нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана финансированием от муковисцидоза Фонд Postdoc-к-факультету Переход премии LIMOLI18F5 (DHL), муковисцидоз Фонд junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), и NIH T32 Учебный грант 5T32HL007638-34 (ASP). Мы благодарим Джеффри Мейснера, Минсу Кима и Итана Гарнера за обмен первоначальными протоколами и советами по визуализации и созданию колодок.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose pads
35 мм Стеклянная подушечка с 20 мм Микро-лунка #1.5 Cover Glass		Cellvis D35-20-1.5-N	Одна для форм для агарозных прокладок, одна для эксперимента
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	06-666A
Низкоплавкое агарозное	Nu-Sieve GTG/Lonza	50081	Для изготовления агарозных прокладок
Шпатели с круглым дном	VWR	82027-492
Шпатели с круглым конусом	VWR	82027-530
Силиконовые изоляторы, Press-to-Seal, 1 лунка, диаметр D 2,0 мм 20 мм, силикон/клей	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	Для форм для агарозных прокладок
Стерильные пластины Петри, 85 мм	Kord-Valmark /продается RPI	2900
Пинцет	VWR	89259-944
M8T Minimal Media
D (+) Глюкоза	RPI	G32045
KH₂PO₄	RPI	P250500
MgSO₄	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na₂HPO₄.7H₂O	Sigma-Aldrich	230391
Tryptone	BD Biosciences	DF0123173
микроскоп
Andor Sona 4.2B-11	Andor	77026135	камера. 4,2 мегапикселя sCMOS с обратной подсветкой, 11 μ m пиксель, QE 95%, 48 кадров в секунду, USB 3.0, байонет F.
Фильтр куб GFP	Nikon	96372	Фильтр куб
Фильтр Cube TxRed	Nikon	96375	Фильтр куб
H201-NIKON-TI-S-ER	Okolab	77057447	Stagetop инкубатор
Nikon NIS-Elements AR с GA3 и 2D и 3D слежением	Nikon	77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950	Программное обеспечение для анализа данных
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Модель Ti2-E	микроскоп
CFI Plan Apo ƛ 20-кратный объектив (0,75 НА)	Nikon	MRD00205	объектив
CFI план Apo ƛ 100-кратный масляный объектив Ph3 DM (1,45NA)	Объектив Nikon	MRD31905
ThermoBox со встроенными тепловентиляторами	Корпус Tokai Hit	TI2TB-E-BK	<
Strong>Bacterial Strains
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)	PMID:		Негомукоидный прототроф
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)		PMID: 9361441
Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2		PMID: 26041805
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)		PMID: 23404398	USA300 CA-метициллин-резистентный штамм LAC без плазмид
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)		PMID: 20829608
Staphylococcus aureus USA300 LAC Δ agrBDCA		PMID: 31713513
Viability Stain
Propidium Iodide	Invitrogen	L7012	LIVE/DEAD™ BacLight™ Набор для определения жизнеспособности бактерий

7604262

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).
Cursino, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Кинетическая визуализация одноклеточных межвидовые бактериальные взаимодействия

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles