Метилирование специфических мультиплексных капель ПЦР с использованием полимерных капель генератор устройства для гематологической диагностики

Summary

Эпигенетические маркеры используются для подзарядки белых кровяных телец (WBC) через количественную оценку моделей метилирования ДНК. Этот протокол представляет собой мультиплекс капли полимеразной цепной реакции (mdPCR) метод с использованием термопластичного еластомера (TPE) на основе микрофлюидного устройства для производства капель позволяет точной и мультиплекс метилирования конкретных целевых количественно WBC дифференциальных кол-

Abstract

Описан мультиплексный рабочий процесс ПЦР (mdPCR) и подробный протокол для определения эпигенетических белых кровяных телец (WBC) дифференциального числа, наряду с термопластичным еластомером (TPE) микрофлюидным устройством генерации капель. Эпигенетические маркеры используются для субтипирования WBC, который имеет важное прогностический значение при различных заболеваниях. Это достигается за счет количественной оценки моделей метилирования ДНК конкретных богатых CG регионов в геноме (cpG локусов). В этой работе, бисульфит-обработанной ДНК из периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) инкапсулируется в каплях с mdPCR реагентов, включая грунтовки и гидролиз флуоресцентные зонды, характерные для cpG локусов, которые коррелируют с суб-популяций WBC. Мультиплексный подход позволяет проводить допрос многих локусов CpG без необходимости отдельных реакций mdPCR, что позволяет более точно определить параметрические поднаселения WBC с использованием эпигенетического анализа мест метилирования. Эта точная количественная оценка может быть распространена на различные приложения и подчеркивает преимущества для клинической диагностики и последующего прогноза.

Introduction

Анализ состава белых кровяных телец (WBCs) является одним из наиболее часто запрашиваемых лабораторных тестов в гематологической диагностике. Дифференциальное количество лейкоцитов служит индикатором для спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и находится под следствием в качестве раннего прогностический биомаркер для ряда других условий, а также. Золотой стандарт в субтипинге WBC включает в себя иммуностиметь и/или цитометрию потока, которые требуют дорогостоящих, подверженных нестабильности флуоресцентных антител и часто сильно зависят от квалификации оператора в подготовке образца. Кроме того, этот метод применим только к свежим образц....

Protocol

Все эксперименты, проведенные в этом исследовании с участием образцов человека, были одобрены Советом по этике СРН и проводились в соответствии с политикой СРН, регулируя человеческие предметы, которые следуют применимым руководящим принципам исследований и соответствуют законам Квебека, Канада.

1. Подготовка клеток

1. Оттепель замороженных человеческих периферических кровяных моноядерных клеток (PBMCs) немедленно, поместив криовиальный в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
2. Переверните криовиальный дважды, чтобы аккуратно повторно использовать клетки и с помощью 1 мл пипетки передачи клеточной подвеск....

Results

Устройство генератора микрофлюидных капель на основе TPE было изготовлено с использованием описанного протокола, как показано на рисунке 1. Маска прозрачности была использована в фотолитографии для получения кремния (Si) мастер. Мягкая литография была выполнена для получения обратной реплики PDMS мастера Si, который затем был использован для изготовления эпоксидной плесени. Прекурсор Epoxy был налил на PDMS и вылечить для перекрестного и затвердевания. Эта плесень, представляющая точную копи.......

Discussion

Представленный экспериментальный протокол и методы позволяют в доме mdPCR с помощью изготовленного генератора капель TPE, тепловой циклер, и флуоресцентный микроскоп. Изготовленное устройство с использованием мягкого TPE для связи TPE обеспечивает гидрофобные свойства поверхности, которые являются однородными во всех стенках канала, так что окончательное устройство не требует какой-либо обработки поверхности для последующего использования в качестве генератора капель. Этот материал регулярно используется в точках ухода п.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Миссиссога, Онтарио,	TFI0201	ПЦР пробирка
RAN Biotechnologies, Беверли, Массачусетс	008-FluoroSurfactant	Фторсодержащее поверхностно-активное вещество
Silicon Quest International, Санта-Клара, Калифорния
Oxford Instruments, Абингдон, Великобритания		EMCCD камера
Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Используется для анализа
Nikon, Япония		10x объектив
American Type Culture Collection (ATCC), Манассас, Вирджиния	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Фишер, Канада
Vitrocom, Нью-Джерси, США	5015 и 5010	Боросиликатная капиллярная трубка
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Япония	LC-L1V5	DEL УФ-источник
Доломит	3200063	Одноразовые жидкостные трубки
Доломитовая	3200302	Одноразовые жидкостные трубки
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Вертикальный световой микроскоп
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä RDING, Австрия
Zymo Research, Ирвайн, CA	D5030
Photron, Сан-Диего, CA
IDT, Коралвилль, IA
Gersteltec, Пулли, Швейцария		SU-8 фоторезист
Fineline Imaging, Колорадо-Спрингс, CO
Qiagen, Хильден, Германия
Изображение J		Используется для оценки диаметра
Анакемия, Монреаль, QC
Excelitas, MA, США		Светодиодная люминесцентная лампа
Galenvs Sciences Inc., Монреаль, QC	DE1010
Hexpol TPE, Å М&Аринг; l, Швеция		Термопластичный эластомер (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Япония		Используется для получения
3M, St Paul, MN		Несущее масло
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Синее флуоресцентное окрашивание живых клеток (DAPI)
IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK fittings
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, США	ARV 310
Ihc world, Maryland, США	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Корбуссен, Германия
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Миссиссога, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Миссиссога, ON
Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк		Инвертированный микроскоп
Nikon, Япония
Loctite	АА 352