El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.
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Artículo de método
Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.
Introducción
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la ....
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Protocolo
1. Preparación de construcciones de expresión
- Recuperar las secuencias de genes de clase I MHC (incluyendo genes predichos) de murciélagos de la base de datos NCBI.
- Recupere secuencias de cadena pesada MHC I de mamíferos superiores de la base de datos de inmuno polimorfismo (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) y la base de datos UniProt (www.uniprot.org).
- Para obtener complejos de MHC solubles, mutar las secuencias para eliminar las regiones citosólicas y transmembranas.
- Clonar los genes que codifican los ectodominios del murciélago Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (residuos 1–277) y bate β2m (Ge....
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Resultados
Trabajos anteriores informaron que el péptido HeV1 (DFANTFLP) derivado del HeV fue presentado por Ptal-N*01:0110,19. En este documento seevaluó la capacidad de unión de este péptido a Ptal-N*01:01 con murciélago homólogo β2m (bβ
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Discusión
La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave de β unión de
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Membrana MMCO de 10 kDa | Millipo Merck PLGC07610 | ||
| 30% de acrilamida | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5× Carga de proteína SDS | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa corte | Merck millipore | UFC901096 | |
| ampicilina | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) cepa | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Use guantes adecuados y protección para los ojos y la cara. En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Los guantes y gafas deben usarse y operarse en una cocina ventilada. En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glicerina | HUSHI 10010618 | ||
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Clorhidrato de guanidina | Amresco | E424-5KG | |
| h & beta; 2m | nuestro laboratorio | Zhang, S. et al. Base estructural de la presentación de alelos cruzados por HLA-A*0301 y HLA-A*1101 revelada por dos complejos de péptidos derivados del VIH. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Clorhidrato de Arginina | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl Solarbio | S8210 | ||
| Marcador | de Proteínas Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare 28990944 | ||
| TEMED | Thermo | 17919 | Los guantes y las gafas deben usarse y operarse en una cocina ventilada. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Triptona | Oxoid | LP0042 | |
| Extracto de levadura | Oxoid | LP0021 |
Referencias
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. ....
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Reimpresiones y permisos
