تهدف هذه المنهجية إلى توضيح الآليات التي تقوم بها الإشارات المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة الركيزة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بتنظيم النمط الظاهري للخلية Schwann (SC).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تفتقر إصابات الجهاز العصبي المحيطي الرضي (PNS) حاليًا إلى العلاجات المناسبة لاستعادة التعافي الوظيفي الكامل. تلعب خلايا Schwann (SCs) ، كخلايا دبقية رئيسية للـ PNS ، دورًا حيويًا في تعزيز تجديد PNS عن طريق إلغاء التنوع في النمط الظاهري للخلية المتجددة بعد الإصابة. ومع ذلك، فإن حالة اللجان SCs غير المتمايزة تشكل تحدياً للحفاظ على الفترة الزمنية اللازمة للتجديد وتتأثر بالتغييرات في المصفوفة المحيطة خارج الخلية (ECM). ولذلك، فإن تحديد التفاعل المعقد بين اللجان الإقليمية واختلاف نظام إدارة المحتوى لتوفير إشارات إلى الإمكانات التجديدية للSCS أمر ضروري. لمعالجة هذا، تم إنشاء استراتيجية حيث تم امتصاص بروتينات ECM مختلفة على الركيزة بوليديميثيلوكسيكان (PDMS) قابلة للتواؤم (PDMS) التي وفرت منصة حيث يمكن تعديل صلابة وتكوين البروتين. تم زرع SCs على ركائز قابلة للتواؤم وتم قياس الوظائف الخلوية الحرجة التي تمثل ديناميات النمط الظاهري SC. لتوضيح التفاعل بين التعبير البروتين SC ومورفولوجيا الخلوية، تم استخدام كثافة البذر المختلفة للSCs بالإضافة إلى أنماط الخلايا المطبوعة الدقيقة الفردية وتتميز بتلوين الفلوروسوس المناعي واللطخة الغربية. وأظهرت النتائج أن الخلايا مع منطقة انتشار أصغر ومدى أعلى من استطالة الخلوية عززت مستويات أعلى من علامات الظهارة التجدد SC. هذه المنهجية لا تبدأ فقط في كشف العلاقة الهامة بين ECM والوظيفة الخلوية للSCs ، ولكنها توفر أيضًا إرشادات لتحسين المواد الحيوية في المستقبل في إصلاح الأعصاب المحيطية.
المقدمة
لا تزال إصابات الجهاز العصبي المحيطي (PNS) تشكل تحديًا سريريًا كبيرًا في مجال الرعاية الصحية من خلال المساس بنوعية الحياة للمرضى وخلق تأثير كبير من خلال العديد من العوامل الاجتماعية والاقتصادية1،2. خلايا Schwann (SC)، كالخلايا الدبقية الرئيسية في PNS، وتوفير الإشارات الجزيئية والمادية اللازمة للحث على تجديد PNS والمساعدة في التعافي الوظيفي في إصابات الفجوة قصيرة. ويرجع ذلك إلى قدرة رائعة من SCs على إلغاء التمايز في "إصلاح" الخلية الظاهرية من myelinating أو Remak النمط الظاهري3. الإصلاح SC هو نوع ظاهري خلية مميزة في عدة طرق. بعد الإصابة، يزيد SCs من معدل انتشارها من خلال الدخول من جديد ف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. Tunable خلية ثقافة الركيزة إعداد وتوصيف
- إعداد الركيزة
- اخلطي مِن قاعدة PDMS والعوامل المعالجة باستخدام طرف ماصة بقوة عند نسبة تتراوح بين 10:1 و 60:1 حتى يتم تشتيت الفقاعات بشكل متجانس داخل الخليط. إزالة الفقاعات باستخدام الجفاف الفراغ حتى يتم تبديد فقاعات.
ملاحظة: أثناء البلمرة PDMS، يعالج وكيل crosslinks مع مِسِر الأساس لتوفير الخصائص الميكانيكية المرغوبة النهائية للبوليمر. يمكن تعديل نسب التشابك المتقاطعة لتغيير صلابة PDMS. - ضع قطرة (~ 0.2 مل) من خليط PDMS المجفف على غطاء مربع أو دائري (على سبيل المثال، 22 مم × 22 مم) وتناوب الغطاء على معطف دوران في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
- احتضان الغطاء في فر....
- اخلطي مِن قاعدة PDMS والعوامل المعالجة باستخدام طرف ماصة بقوة عند نسبة تتراوح بين 10:1 و 60:1 حتى يتم تشتيت الفقاعات بشكل متجانس داخل الخليط. إزالة الفقاعات باستخدام الجفاف الفراغ حتى يتم تبديد فقاعات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحليل وقياس التفاعل بين صلابة الركيزة وتكوين البروتين على النمط الظاهري SC، تم تطوير الركيزة الوراثية لثقافة الخلايا PDMS(الشكل 1A). اختبار ضغط البوليمر في قاعدة مختلفة: تم استخدام نسب عامل المعالجة لتحديد معامل يونغ (E) من الركيزة (الشكل 1B). يمثل النطاق الناتج من قيم المعامل الظروف الركيزة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بعد إعداد ركائز، تم استزراع SCs وتحليل الخصائص الخلوية على البيئة الدقيقة القابلة للتواؤم. تم أولا تحليل معدلات انتشار SCs على ركائز من تك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن تعزز SCs تجديد الأعصاب بسبب تحولها الظاهري وإمكانات التجدد بعد إصابة الأعصاب. ومع ذلك، فإن كيفية تنظيم الإشارات في إدارة المحتوى في الميكون هذه القدرة التجديدية لا تزال غير واضحة في معظمها، مما قد يعوق ليس فقط تطوير المواد الحيوية التي تهدف إلى تعزيز تجديد الأعصاب ولكن أيضا فهم الآليات المشاركة في تجديد الأعصاب. للبدء في دراسة هذا التفاعل، تم إنشاء ركائز ثقافة الخلية حيث يمكن التحكم في إشارات ECM مثل التصلب وطلاء البروتين والتضاريس اللاصقة. القدرة على تضاريس لاصقة micropattern هو سمة رئيسية داخل البروتوكول ، وذلك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
ويعترف المؤلفون بامتنان بالدعم التمويلي المقدم من جامعة سينسيناتي. كما يشكر المؤلفون رون فلنينكين من مختبر توصيف المواد المتقدمة بجامعة سينسيناتي على الدعم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الألبومين من مصل الأبقار (BSA) ، تلطيخ تكساس الأحمر المترافق | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA لإظهار الأنماط الدقيقة |
| المضادة للفأر IgG ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة | المرتبطة ب HRP 7076S | المستخدمة لتحليل اللطخة الغربية | |
| IgG المضادة للأرانب ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP | 7074S | المستخدمة لتحليل | |
| اللطخة الغربيةكاشف BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | المستخدم لقياس تكاثر الخلايا |
| الجسم المضاد الأساسي BrdU المقترن مع Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | يستخدم لتصور BrdU في فحوصات تكاثر الخلايا |
| الكولاجين الأول | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | البروتين المستخدم لطلاء أغطية آلة |
| اختبار قوة | TestResources | أداة لتحديد الخواص الميكانيكية للبوليمرات | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell Cell Medium |
| مصل الأبقار | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell Cell Medium |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | البروتين المستخدم لطلاء الغطاء |
| مضان مجهر | نيكون | كسوف Ti2 | مجهر مضان |
| مثبط البروتياز والفوسفاتيز (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | مثبط البروتياز والفوسفاتيز |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | البروتين المستخدم لطلاء أغطية |
| التركيب مع DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant و تلطيخ النوى |
| الفأر c-Jun الجسم المضاد الأولي | Thermo Fisher Scientific | 711202 | الجسم المضاد الأساسي لتصور بروتين c-Jun |
| Mouse & beta - الأكتين الأجسام المضادة الأولية | تقنية إشارات الخلايا | 3700S | التحكم في التحميل لتجارب اللطخة الغربية |
| البنسلين الستربتومايسين | الحراري فيشر 15140122 | العلم وسط زراعة الخلايا التكميلي | |
| مقاوم للضوء SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | مقاوم للضوء |
| بلورونيك F-127 | سيجما ألدريتش | P-2443 | كتلة ربط البروتين غير المحدد |
| الأرنب c-Jun الجسم المضاد الأساسي | تقنية إشارات الخلية | 9165S | الجسم المضاد الأساسي لتصور بروتين c-Jun |
| الجسم المضاد الأساسي للبروتين الأرانب المايلين الجسم المضاد الأساسي | Abcam | ab40390 | الجسم المضاد الأساسي لتصور MBP |
| Rabbit p75NTR الأجسام المضادة الأولية | تقنية إشارات الخلية | 8238S | الجسم المضاد الأساسي لتصور p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | تصور الهيكل الخلوي |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | المخزن المؤقت لتحلل الخلية |
| RT4-D6P2T Schwann خط الخلية | ATCC | CRL-2768 | الخلية المستخدم في التجارب |
| SYLGARD 184 قاعدة PDMS وعامل المعالجة | Sigma Aldrich | 761036 | بوليمر قابل للضبط يستخدم لطلاء الغطاء |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | كاشف تفكك الخلية |
| منظف الأشعة فوق البنفسجية والأوزون | Novascan | زيادة هيدروفيسيلية PDMS | |
| Versene (1x) | تفكك الخلايا 15040066 Thermo Fisher | الكاشف |
المراجع
- Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
- Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
